科普 | 几种常见干细胞的制备方法

撰文│杏　仁

编辑│李佳潞

审校│汤红明

来源：东方干细胞科普团

干细胞存在于人体的各项组织器官中，骨髓、外周血、胚胎、脐带、脂肪、乳牙、智齿、尿液等都存在干细胞，人体中的干细胞经过了一系列的严谨规范的制备和质检流程，成为合格的干细胞制剂，便可应用于临床试验。

然而，从以上组织器官中将干细胞“找”出来，可没那么容易！下面将一一介绍干细胞家族中的几位“明星”~

造血干细胞

Hemopoietic stem cells

造血干细胞可分为脐带血造血干细胞、骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞，其来源分别为脐带血、骨髓、外周血。

造血干细胞具有来源丰富、移植技术相对成熟等优点，可用于治疗再生障碍性贫血、急性白血病等血液系统疾病。

造血干细胞的培养通常采用血液分选法。

在无菌状态下使用连接管引出脐带静脉中的脐带血，由取血员在24小时运送回脐血库。相关人员对制备前的脐带血细胞数进行检测。在依照GMP标准设立的实验室中，通过封闭状态下离心，完成脐带血造血干细胞的分离，并对制备后的脐带血细胞数进行检测。

一般情况下，骨髓中的造血干细胞较多，外周血中的造血干细胞数量极少。随着科学技术的发展，现基本采用外周血采集替代从骨髓中抽取的方式获得造血干细胞，其过程如同献血，极大减轻了供者的痛苦。

采集外周血干细胞前，需提前5天注射重组人粒细胞集落刺激因子（干细胞动员剂），刺激骨髓造血干细胞升高，并释放到外周血里，再使用血细胞分离仪器，即可提取出外周血造血干细胞。

脐带间充质干细胞

Mesenchymal stem cells

脐带间充质干细胞来源于脐带，主要分布在华通氏胶和脐带血管周围。

脐带间充质干细胞具有扩增能力强、免疫原性低等优点。相关研究表明，脐带间充质干细胞在心力衰竭、糖尿病、急性脊髓损伤、移植物抗宿主病、卵巢早衰、阿尔兹海默症、帕金森病、新冠病毒感染等疾病的治疗中表现出良好的安全性和疗效。

脐带间充质干细胞的培养通常采用组织块贴壁法。

取脐带前，须经产妇同意，在其分娩后，由专业人员剪断连接婴儿端和母亲的脐带，并立刻用脐带夹夹住，装入无菌袋中。

将脐带迅速移入装有PBS的容器中浸泡清洗2次，洗净残留血液。剪掉脐带夹，将脐静脉、脐动脉及脐带包膜去除，剥离华通胶。剪碎华通胶组织，加入培养液于培养箱中培养。

每天在显微镜下观察细胞生长情况。组织块贴壁牢固后，补加培养液10~15ml，3~4天换1次培养液。见大量细胞贴壁后轻晃培养瓶，使组织块脱离瓶底，将其接种于新培养瓶中，加入新鲜培养液继续进行贴壁培养。同一脐带组织块至少可反复进行3次重复贴壁培养，依据细胞生长情况每隔3~4天换液1次。之后根据细胞生长情况进行换液、传代，即可培养出脐带间充质干细胞。

脂肪干细胞

Adipose-derived stem cells

脂肪干细胞来源于脂肪组织，主要分布在皮下、内脏周围、肌肉间隙及乳房组织。

脂肪干细胞具有分布广泛、储量丰富等优点。相关研究表明，脂肪干细胞能够有效治疗骨关节炎、心肌梗死、复杂性肛瘘等疾病。

脂肪干细胞的培养通常采用酶消化法。

在无菌状态下抽取脂肪组织，PBS漂洗后充分剪碎至糊状，加入Ⅰ型胶原酶，置于摇床中37℃下震荡30分钟进行消化。

终止消化后离心，去上清液及未消化的脂肪，少量培养基重悬细胞沉淀，0.16 mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，离心后得到单个核细胞。经过计数后进行传代培养，即可得到脂肪干细胞。

牙髓干细胞

Dental pulp stem cells

牙髓干细胞来源于乳牙、智齿、正畸牙，主要分布在牙髓中。

牙髓干细胞具有具有活性强、无伦理争议等优点。相关研究表明，牙髓干细胞可用于治疗牙周炎、脑卒中、脊髓损伤等疾病。

牙髓干细胞通常采用酶消化法。

将脱落或拔除的牙齿置于75%酒精中浸泡30min，PBS清洗牙齿，持骨钳夹碎牙根，暴露出牙髓。

取出牙髓并置于PBS中，将牙髓组织剪碎，加入Ⅰ型胶原酶后置于摇床中，37℃下震荡30分钟，100目滤网过滤，离心后弃上清，调整细胞浓度进行进一步培养，即可得到牙髓干细胞。

尿源性干细胞

Urine-derived stem cells

尿源性干细胞来源于肾脏，主要分布于尿液中。

尿源性干细胞具有无创取材等优点。相关研究表明，尿源性干细胞可用于治疗糖尿病肾病、肝损伤、阴茎勃起功能障碍等疾病。

尿源性干细胞来源于尿液。具有无创取材等优点。

尿源性干细胞通常采用贴壁筛选法。

取0.1%明胶置于细胞培养板孔底铺平，放置37°C培养箱30分钟以上备用（在明胶不蒸干的情况下可以保存两周）。制备前提前将包被好的明胶自然风干。

无菌取尿瓶表面喷75%酒精消毒，受试者戴无菌手套，进行200ml或以上清洁中段尿收集。75%酒精消毒尿瓶外表面，将尿液放入离心管中离心。弃尿上清，PBS吹打混匀沉淀。离心后弃上清，专用培养基重悬沉渣，置于细胞培养箱中进行培养。

第8天开始在光镜下观察是否有克隆形成，待克隆细胞融合度达90%以上后进行消化，通过后续培养即可获得尿源性干细胞。

以上就是几种干细胞制剂常见的制备方法。但传统的2D培养体系单批次生产细胞数量少，难以满足大量患者需求，且存在培养周期长、污染风险高、生产成本大、批间差异大等不足，干细胞规模化生产迫在眉睫。

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目前，同济大学附属东方医院干细胞基地GMP实验室研制的干细胞3D低氧规模化生产设备解决了以上问题，在生产工艺上，其主要有以下几个创新点：

（1）采用3D低氧的培养条件，有效降低活性氧物质（ROS）的积累，减少DNA损伤，提高细胞活力和细胞干性；

（2）可进行大规模的细胞培养，细胞一批次可获得上千亿级别的数量，成本比传统的培养方式降低至少10倍以上；

（3）B+A生产环境采用隔离器装置，降低中间过程污染的风险；

（4）采用世界上最先进的细胞成像获取和数据分析软件，实时监控细胞生长的状态。

干细胞3D低氧规模化生产设备拟解决干细胞数量级的瓶颈问题，为后续成药性、基础研究和转化研究提供良好的平台和示范点，努力推动干细胞成药性的进程。

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