加强再生医学：干细胞疗法的关键作用

干细胞由于其自我更新和多能分化能力，为修复和替换受损组织和器官提供了新的治疗途径。在本文中，我们对各种类型干细胞的特征进行了系统回顾，并深入了解它们在细胞和无细胞疗法中的潜在应用。

此外，我们对干细胞治疗的技术路线进行了全面的总结，并详细讨论了当前的挑战，包括安全问题和分化控制。尽管仍然存在一些问题，但干细胞疗法在再生医学领域展示了巨大的潜力，并为管理更广泛的疾病和创伤提供了新颖的策略和方法。

介绍

器官损伤和退行性疾病是由于衰老或功能丧失导致的细胞死亡引起的，会严重影响人们的生活。此类病症的例子包括帕金森病、阿尔茨海默病、肝硬化和听力损失等退行性疾病，以及心肌梗塞和皮肤烧伤等损伤性疾病。肝脏等器官具有较高的再生能力，在某些情况下可以充分再生以维持功能稳定性。

小鼠肝脏已表现出强大的再生能力，可在部分肝切除术后支持肝功能。不幸的是，大多数组织和器官不具备这种再生能力，受伤后无法自我修复，最终导致功能丧失。一个例子是耳蜗中的毛细胞，一旦受损就无法再生，从而导致不可逆转的听力损失。这些患者将需要人工耳蜗，即通过手术将包含电极阵列和接收器的电子设备植入患者的内耳，以直接刺激听觉神经并恢复患者的部分听力。同样，心脏瓣膜受损的患者需要更换由金属或生物材料制成的人工瓣膜，以维持心脏功能（图1） 。

人工器官替代很复杂，移植后患者可能会出现感染或免疫排斥。一些炎症反应，例如感染性心内膜炎，可能是致命的。因此，需要一种免疫原性弱的治疗方法，能够有效修复患者受损的组织和器官，旨在最大限度地减少不良事件的发生。干细胞（SC）具有分化为多种细胞的巨大潜力，并且可以无限增殖。在移植到患者体内以替换退化或坏死细胞之前，可以在体外诱导SC分化为特定细胞或组织类型。此外，干细胞可以分泌抗炎因子、细胞因子和外泌体来抑制炎症反应，改善受损区域的微环境，最终调节细胞增殖和分化。该综述全面概述了干细胞治疗的机制研究和临床应用，同时也指出了该领域的相关问题。

干细胞的分类

SC是具有多向分化潜力的细胞，同时保留自我复制和更新的能力。可根据其分化能力的程度进行分类（表1）。

全能干细胞（TSC）是一种干细胞，具有分化为生物体内任何细胞类型的卓越能力，包括胚胎发育所需的胎盘细胞。TSC存在于胚胎发育的最早阶段，通常是在受精后的受精卵阶段，此时精子细胞使卵细胞受精。此时，受精卵形成，具有发育成完整生物体的潜力。

TSC通常具有许多独特的分子特征，包括较低的DNA甲基化和内源性逆转录病毒成分（ERV）的激活。TSC状态可以通过多种方法诱导。GSK抑制剂1-azakenpaullone、视黄酸类似物TTNPB和激酶阻断剂WS6的混合物可以诱导小鼠胚胎干细胞（ESC）在受精卵和二细胞阶段表现出与TSC相似的表型。此外，异染色质重塑也被证明有助于建立同种异型特异性的H3K4me3结构域，从而有效促进ESC从多能性向同种异型的转变。TSC分化为整个生物体的独特能力引起了发育生物学和再生医学研究的极大兴趣。尽管如此，仍然存在与其使用和研究相关的特定伦理问题。

多能干细胞 (PSC) 以其在所有三个胚层（外胚层、内胚层和中胚层）分化成各种特殊细胞类型的卓越能力而闻名。具体而言，PSC表现出分化为外胚层衍生物的显着能力。它们产生神经元、神经胶质细胞、神经嵴细胞和源自外胚层的其他细胞类型的能力证明了这一点。它们通常源自囊胚阶段的ESC，或通过使用四种转录因子对成体细胞进行重编程而获得诱导多能干细胞 (iPSC)：Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。

iPSC最显着的优势在于它们源自分化的体细胞，提供了SC的优势，同时显着避免了与TSC和ESC相关的伦理问题。培养中的 iPSC 具有无限的自我更新能力，可以产生几乎无限量的特化细胞，为人类早期发育、疾病建模和再生疗法的研究提供了巨大的潜力。

成体干细胞 (ASC) 被归类为多能干细胞，与多能干细胞相比，其分化能力更受限制。这些细胞存在于全身的各种组织和器官中，在特定微环境中发挥维持、修复和再生组织的作用。与多能干细胞不同，多能干细胞具有从多个胚层分化成多种细胞类型的更广泛潜力，而ASC的分化范围受到更多限制。它们通常产生特定于其组织或起源器官的细胞类型，并且比多能干细胞更加特化。因此，ASC只能产生与其起源的确切组织相对应的特定细胞谱系，这不同于其多能干细胞对应物所表现出的更广泛的分化潜力。

最常见的ASC包括造血干细胞（HSC；负责在骨髓中产生血细胞）、间充质干细胞（MSC；在各种组织中分化为脂肪、软骨和骨细胞） ）和神经干细胞（NSC；分化为神经系统的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞）。ASC的特点是在成体组织中相对丰富、通过分泌特定信号分子调节微环境的能力以及易于分离。因此，它们对于组织器官修复和癌症治疗具有重要价值。

单能干细胞（USC）是干细胞中的一个特殊亚群，其分化潜力明显受限。与能够产生多种细胞类型的多能或多能干细胞相反，USC仅致力于产生单一特定细胞类型。这些细胞主要存在于特定的组织或器官中，在维持、修复和恢复它们所居住的特定组织方面发挥着至关重要的功能。USC常见于成人组织中，能够持续补充消耗的特定细胞群，在组织维护和修复中发挥着至关重要的作用。USC的例子包括皮肤中的基底细胞和骨骼肌中的卫星细胞。USCs在疾病治疗方面的潜力因其单一的分化模式而受到限制。

干细胞治疗的技术路线

要使用干细胞进行治疗，首先必须考虑干细胞的来源。考虑到它们的分化能力和伦理问题，目前最广泛用于治疗的SC是PSC和ASC。ESC通常源自囊胚的内细胞团。iPSC的产生如上所述，ASC来源于多种成体组织，包括脂肪组织、骨髓、神经组织、血液、骨骼肌等，这提供了方便的细胞来源。

为了维持SCs的多代自我更新能力和分化能力，需要专门的培养系统来支持。培养基中不同的生物材料会影响SC的分化潜力和扩增能力。含有寡肽接枝水凝胶的培养基已被证明可以增强人类ESC和iPSC的增殖和多能性。使用含有人血浆和人胚胎提取物的培养系统可最大限度地提高传代次数，同时保持iPSC的自我更新和分化潜力。此外，与2D培养相比，3D培养系统可以更好地模拟干细胞体内的微环境，增强不同干细胞物种的干性。例如，3D细胞培养物和天然脑组织提取物的结合可以加速SC分化为神经元表型。

对于干细胞治疗来说，最关键的步骤是通过调节培养条件和信号分子来引导SC向靶细胞类型分化。这可以通过模仿胚胎发育过程中的信号通路和微环境来实现。研究表明，内耳发育与成纤维细胞生长因子（FGF）信号传导密切相关。刺激人类ESC中的这条通路可以诱导两种类型的耳祖细胞分别分化为内耳毛发样细胞和听觉神经元。Wnt信号的轻度激活可促进MSC分化为软骨形成细胞。

在纳米材料复合材料表面培养细胞也会影响细胞的粘附和生长特性，从而通过细胞骨架结构的变化触发力转导诱导的基因表达变化。通过这种方式，小鼠肾源性SC被诱导分化为足细胞或近端肾小管细胞。

通过上述方法的组合和优化，可以实现SC的定向分化。在确保分化过程的有效性和稳定性后，需要进行细胞鉴定和功能验证，包括细胞表型分析、基因表达分析和功能评估，以确认分化后的细胞类型符合预期，从而确保所得细胞具有所需的属性和功能。

最后，经过分化和验证的SC通过不同的载体和支架移植到患者体内。在此阶段，增强干细胞在组织中的保留对于治疗效果至关重要。最常用的方式是将SC的盐水悬浮液直接注射到目标器官或组织中。

综上所述，完整的干细胞治疗流程包括三个重要方面：干细胞的产生和扩增、靶向分化和应用，以及针对不同临床领域需要选择最佳技术路线以实现受损组织器官的再生和功能恢复（图2）。

干细胞疗法的应用

用于器官和组织再生的细胞疗法包括一系列旨在通过将外源细胞引入体内来修复或再生受损组织或器官的方法。除其他方法外，干细胞疗法构成了该领域的一个重要方面，利用特定细胞群的再生潜力来恢复从退行性疾病到损伤等各种情况下的组织功能。

器官和组织再生的细胞疗法

基于细胞的疗法通过多种机制发挥作用，包括细胞分化、生长因子和细胞因子等生物活性分子的分泌、免疫反应的调节以及组织修复和重塑的促进。退行性和损伤性疾病，包括循环系统、内分泌和神经系统疾病，有可能通过 SC 疗法得到恢复。

第一个临床应用是在血液学领域，涉及从血液系统移植造血干细胞（HSC）。HSC移植现已成为血液恶性肿瘤和遗传性血细胞疾病的护理标准。通过分析人类白细胞抗原 (HLA) 区域内的基因，找到最佳HLA匹配的供体和受体，可以最大程度地减少移植物抗宿主病 (GVHD)。为了避免供体匹配的限制和潜在的免疫并发症，对患者自身HSC进行基因校正或基因编辑极大地提高了血液疾病移植治疗的效率。

Wiskott-Aldrich综合征 (WAS) 的特征是巨血小板减少症、湿疹、自身免疫和淋巴恶性肿瘤，是由WAS基因突变形式的表达引起的。通过慢病毒转染正确的基因，然后将修饰的HSC输注到患者体内，患者自身的HSC中的这种突变已得到纠正，患者的免疫功能和临床症状均得到改善。

在镰状细胞病中，通过γ-逆转录病毒和慢病毒载体或直接靶向将球蛋白基因（γ-球蛋白、γ/β-球蛋白杂交体和抗镰刀β-球蛋白）引入HSC，可逆转血红蛋白异常。胎儿γ-珠蛋白抑制基因BCL11A。

干细胞疗法在治疗耳聋方面也显示出巨大的潜力。ESC与胰岛素样生长因子-1（IGF）、表皮生长因子（EGF）和bFGF联合治疗可以诱导ESC表达内耳祖细胞标记物，包括ATOH1。Oshima等人将ESC/iPSC与来自胚胎鸡卵囊的基质细胞共培养。鉴定出一类具有短微绒毛的毛束细胞，其电生理特性类似于未成熟的毛细胞。该方法进一步完成了SCs向毛细胞的逐步分化。用SC治疗遗传性听力损失还需要基因编辑的帮助。在患有MYO7A突变的耳聋患者中，需要对iPSC进行CRISPR/Cas9基因校正，以恢复分化的毛细胞样细胞的正常形态和功能。

基于细胞的干细胞疗法也逐渐完善，用于治疗心脏和皮肤疾病。心肌细胞是完全分化的细胞，再生能力有限，决定了损伤后心脏功能不可逆的丧失。ESC和iPSC的心肌细胞的再分化有望进一步改善受损心脏组织的功能。随着基因编辑的加入，SCs已被用于改善心脏疾病的治疗，包括引入Akt1来增强心脏祖细胞的增殖，以及修饰SDF-1/CXCR4促进心脏SC募集的基因。在皮肤伤口愈合方面，SCs治疗主要是减少愈合时间、伤口挛缩和疤痕形成的风险。

综上所述，基于细胞的干细胞疗法通过用正常干细胞分化产生的细胞直接替代受损组织来恢复组织功能，或者通过基因编辑纠正异常干细胞，从而恢复正常组织和器官功能。虽然展示了促进组织再生和逆转特定病理状况的潜力，但仍然存在一些挑战，包括免疫排斥问题、伦理考虑以及移植后不受管制的细胞行为相关的风险。

无细胞旁分泌疗法

越来越多的证据表明，除了直接细胞替代疗法外，干细胞，特别是间充质干细胞，还分泌蛋白质、生长因子、细胞因子和趋化因子，对周围细胞或微环境产生影响，以支持组织再生。这些分泌产物统称为SC分泌组，能够通过影响不同细胞类型（包括组织特异性细胞、免疫细胞、血管内皮细胞和细胞外基质中的成纤维细胞）的信号传导途径来调节受损组织的微环境。

由于其免疫调节特性，间充质干细胞归巢并迁移至损伤部位后，会产生不同的调节因子来调节微环境中的免疫反应。用于癌症治疗的免疫检查点抑制剂，例如抗PD-1/PD-L1，也可诱发自身免疫1型糖尿病，而 MSC衍生的外泌体可显着预防抗PD-1/PD-L1诱发的小鼠糖尿病。

SC还可以分泌促进微环境中血管生成的因子，同时它们自身分化成合适的细胞类型来替代受损细胞。胎儿皮肤就是这种情况，其中SC分泌组通过增强与胎儿皮肤再生和血管生成相关的靶基因（包括VEGF、Ang-1、Ang-2和PLGF ）的转录活性来促进HUVEC细胞增殖和血管生成。

综上所述，SCs的旁分泌分泌物可以调节淋巴引流，促进血管生成，保证营养供应，同时补充受损细胞。

除了正常微环境外，SCs还可以调节肿瘤微环境（TME）。源自MSC的富含MicroRNA-100 的外泌体可以通过mTOR/HIF-1α信号传导抑制乳腺癌细胞中 VEGF 的表达，最终抑制TME中的血管生成。

总之，基于干细胞的无细胞疗法显示出巨大的前景，它们能够调节组织微环境，从而比干细胞重新分化以补充受损细胞的细胞疗法治疗更多样的疾病。与细胞疗法相比，无细胞旁分泌疗法具有多种优势，包括降低免疫排斥风险、简化储存和给药过程以及潜在更少的安全问题（表2）。

当前的挑战

在基于SC的疗法快速发展的当前阶段，重要的是不要忽视它们带来的一些问题。

首先要考虑的问题是SC的来源，因为存在伦理和法律方面的考虑。ESC的使用受到伦理争论和法律限制，而成人SC的获取和放大在技术上很棘手，并且存在质量控制问题。长时间连续培养引起的另一个问题是细胞活力丧失，导致增殖和分化能力降低。解决这个问题需要使用新材料，例如二氧化硅纳米粒子，以干燥状态长期保存干细胞。

其次，SCs分化的效率和方向是一个主要问题，因为这决定了治疗的有效性。定向分化是一个我们尚未完全理解的复杂过程，细胞培养条件、细胞因子和信号通路等许多因素都会影响该过程。因此，仍需要更多的研究来更好地控制SC的分化方向和质量，以预防肿瘤发生等不良事件。

干细胞治疗的另一个关键决定因素是靶向细胞迁移的能力。在发挥其分化作用之前，干细胞必须有效地输送到预定部位。目前，大多数干细胞治疗方法采用静脉内药物输送，其在促进从血液循环到组织的靶向迁移方面效果有限。移植的干细胞的存活是干细胞治疗面临的另一个主要问题。SC疗法的特点是MHC和HLA表达低，有可能降低免疫原性并显着增强对移植物抗宿主反应的抑制。然而，由于与SC治疗相关的预扩张技术的局限性，其免疫特权逐渐受到损害。

输注到人体后，体内炎症因子的存在进一步增强了干细胞的免疫原性，从而增加了排斥的风险。移植后的细胞存活和生长受到宿主免疫系统的影响，因为宿主对同种异体细胞的免疫反应直接导致移植排斥。解决同种异体排斥的一种可能的解决方案是通过基因编辑敲除免疫相关基因，生成免疫相容的SC。需要进一步的研究来解决这些和其他挑战，以成功地将干细胞疗法转化为临床。

总结和观点

自Ernst Haeckel于1868年首次发现干细胞以来，这些细胞的发育经历了几个关键阶段。最初，干细胞是从各种组织中分离和鉴定的，随后iPSCs的开发以及基因编辑与SCs的结合，导致干细胞治疗的逐步完善。由于干细胞的多向分化能力，其最直接的应用是基于细胞的治疗。这种方法涉及将SC（同种异体和转基因自体SC）注射到疾病或损伤部位，以促进组织再生和功能恢复。

然而，干细胞疗法也面临许多安全问题。同种异体干细胞会触发患者的免疫系统，导致移植物排斥，而移植的SCs过度增殖和分化可能导致肿瘤形成。因此，确保干细胞治疗的安全性是一项重大挑战。在干细胞治疗中，确保干细胞能够定向分化为靶细胞类型并保持其功能和稳定性也至关重要。需要进一步的研究和改进的分化技术来确保分化的细胞具有所需的特性。

总之，作为再生医学中重要的治疗工具，干细胞疗法在细胞本身及其分泌成分中以多种方式发挥着至关重要的作用。随着对干细胞特性和功能的深入了解，预计更多的疾病和损伤将能够从干细胞治疗中受益。

参考资料：Wang J, Deng G, Wang S, Li S, Song P, Lin K, Xu X and He Z (2024) Enhancing regenerative medicine: the crucial role of stem cell therapy. Front. Neurosci. 18:1269577. doi: 10.3389/fnins.2024.1269577

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