基于干细胞的再生医学的观点，特别强调间充质干细胞治疗

概述：再生医学是一种旨在利用干细胞等再生缺失或功能障碍的器官和组织来恢复失去的人体功能的医学治疗方法。再生医学中使用的干细胞主要分为三种类型：诱导多能干细胞（iPS细胞）、胚胎干细胞（ES细胞）和间充质干细胞（MSC）。

间充质干细胞因其具有分化为多种类型细胞、修复细胞和组织的能力，有望广泛应用于再生医学领域；抗炎作用；分泌各种生长因子；和解决异常积累的淀粉样蛋白。间充质干细胞可以来源于骨髓、牙髓和其他来源，但脂肪组织源性干细胞（ADSC）可能更优越，因为它们可以通过最少的侵袭来收获，因此可以获得足够量的干细胞可以相对容易地培养。当间充质干细胞通过静脉输注全身给药时，它们往往会在疾病部位积聚，这种特性被称为“归巢”，这对于临床应用极为有利。

在日本，干细胞治疗的研究或治疗计划必须经过“再生医学特别批准委员会”审查批准，并按照“再生医学特别批准委员会”提交厚生劳动省批准后才能进行干细胞治疗。 《确保再生医学安全法》并经进行治疗的机构的伦理委员会批准后。本文综述了间充质干细胞的特点、临床应用的现状以及未来的前景。

介绍：什么是再生医学？

再生医学是一种旨在使因疾病或事故而损失的身体组织再生的医学治疗方法。人们经常使用“根本治疗”这个词，它的目的是从根本上恢复失去的组织和器官。

组织工程是“通过结合生命科学和工程学来替代失去功能的器官和组织的技术”。具体来说，就是通过以下三个要素来创造人造器官和组织：患者的“细胞”、为细胞运作提供非常重要的场所（框架）的“基质”以及提供细胞功能的“生物活性物质”。是对我们的身体有积极影响的营养成分。人工制造器官和组织，需要具有强大分化能力的干细胞。

干细胞主要分为三种类型，代表再生医学中使用的干细胞。诱导多能干细胞（iPS细胞）和胚胎干细胞（ES细胞）具有这种能力，这正是人造器官和组织的创建及其临床应用的原因开始了。

另一种类型的干细胞，即间充质干细胞 (MSC) ，也能够分化，并且在不久的将来可能会建立类似的治疗方法。虽然间充质干细胞相对于其他两类干细胞有一些优势，例如不需要基因操作、没有特定的癌症风险、没有伦理问题等，但它们不具有高分化潜力，尚未被应用于生产所需的细胞。间充质干细胞临床应用的主要原因不是组织器官的再生和移植，而是具有修复受损组织器官或组成它们的细胞的能力。MSC疗法包括施用未分化的干细胞，iPS细胞和ES细胞在施用前总是分化的；这是它们之间的关键区别，即iPS细胞或ES细胞和MSC。

干细胞类型及其发现历史

再生医学中使用的干细胞主要分为三种类型：诱导多能干细胞细胞、胚胎干细胞和间充质干细胞。因为前两者具有很强的分化潜力，所以不能以未分化的形式给予人体，否则会在体内不受控制地分化，产生畸胎瘤等肿瘤，但它们可以分化为特定的细胞和组织，并在再生医学中用作受损细胞和组织的替代品。

iPS细胞与ES细胞一样，有潜力成为体内的任何细胞。iPS细胞是通过将一些基因（Oct3/4、Sox2、c-Myc 和 Klf4）插入成人皮肤或血细胞中而产生的，而ES细胞是从早期受精卵的一部分中获得的，这需要牺牲受精卵。大多使用体外受精剩下的受精卵，但破坏受精卵这个生命的胚芽的伦理问题是不可避免的。

诱导多能干细胞的临床应用

iPS细胞的临床应用在日本取得了进展，这可能是因为它们在日本的发现和诺贝尔奖的授予。由于iPS细胞是来自另一个家族的细胞，因此移植时可能会发生排斥反应。正在尝试两项创新来减少这种排斥：

• 一是匹配人类白细胞抗原（HLA）类型（再生医学iPS细胞储备项目），
• 二是使用CRISPR-Cas9基因组编辑技术来创建iPS细胞在其他家庭移植时免疫排斥的风险较小。目前的临床应用包括色素性视网膜炎、帕金森病、以及扩张型心肌病和缺血性心肌病等严重心脏病。

2020年1月，第一例人类受试者被植入iPS细胞衍生的心肌细胞片。由于iPS细胞可以分化成多种组织，因此它们在治疗多种疾病方面具有潜在的应用前景。在这种情况下，尤其重要的是，细胞首先是完全分化的，即没有未分化的细胞残留；否则，它们在移植后可能会偏离其预期目的，并且肿瘤形成是一个特殊的问题。由于iPS细胞采用基因重组技术，移植后不应出现异常基因的表达。努力匹配HLA类型对于防止排斥反应非常重要。

迄今为止，临床应用中尚未发现癌症、排斥或基因表达异常的证据。当然，iPS细胞在非临床研究中的应用，比如药物开发，是iPS细胞的主要应用之一，在这种情况下，基因表达异常、癌变等“副作用”就不会那么重要了。

间充质干细胞

MSC是成体干细胞，能够分化为中胚层来源的组织，如骨、软骨、血管和心肌细胞，以及外胚层来源的神经元和神经胶质细胞，甚至内胚层来源的肝细胞。

国际细胞治疗学会使用以下标准来定义人类 MSC：(1) 在标准培养条件下粘附于塑料，(2) 细胞表面标记 CD73、CD90和CD105呈阳性，CD11b或CD14、CD19呈阴性或CD79α、CD34、CD45和HLA-DR，以及(3)分化成成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的能力。

间充质干细胞已在多种身体组织中发现，包括骨髓、肌肉、皮肤、脂肪组织、脐带、牙髓和牙周组织。

间充质干细胞的首次临床应用是1957年Thomas等人进行的造血干细胞骨髓移植。

1990年，他与约瑟夫·默里（Joseph Murray）因建立了骨髓移植治疗血液疾病的方法而获得诺贝尔生理学或医学奖。

1966年，弗里登斯坦等人继1958年Denis报道皮下移植的骨髓停止造血、产生网状组织并导致骨形成之后，证实将骨髓碎片和骨髓悬浮液异体移植到小鼠体内会导致网状组织的形成，有时还会导致骨形成。

1962年，与山中伸弥 (Shinya Yamanaka) 因创建iPS细胞一起获得2012年诺贝尔奖的约翰·B·格登 (John B. Gurdon ) 通过将体细胞核移植到青蛙卵中，创造出了克隆青蛙。

ES细胞由Martin Evans于1981年建立，他培养了囊胚内细胞团的细胞，发现了多能细胞，并于2007年获得诺贝尔奖。

1999年，Mark F. Pittenger等人建立了ES细胞。证明了MSC的多能性，即MSC可以分化为软骨、骨、脂肪细胞和肌肉。德巴里等人。发现了滑膜来源的MSC，Zuk等人。均于2001年发现了脂肪组织来源的间充质干细胞 (ADSC) 。间充质干细胞可以从许多组织中获得，包括脐带、胎盘和羊膜等胎儿附属物以及牙髓。

干细胞不仅存在于儿童期，也存在于成年期，并且在整个生命过程中，它们都发挥着替代受损组织的作用。其中，存在于骨髓中的造血干细胞是半个多世纪以来最先被研究的，并且其临床应用一直在积极推进。造血干细胞移植技术的建立，开启了利用任何组织干细胞进行移植治疗的可能性。

然而，从某些组织（例如大脑和心脏）中分离干细胞很困难，这使得它们很难用于治疗。但幸运的是，MSCs被发现不仅具有分化成成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和软骨细胞等中胚层细胞的能力，而且还具有分化成内脏组织等内胚层细胞和神经元等外胚层细胞的能力，预计将被广泛应用。应用于“再生医学”。

间充质干细胞是体内原本存在的细胞。它们不是基因工程细胞，也不是人工创造的细胞，因此它们患癌症的几率不太可能更高。也不存在伦理问题，因为它们不是通过破坏胚胎细胞获得的。尽管它们不是像iPS细胞或ES细胞那样的多能细胞，但体内的MSC在保护和修复组织、平息炎症以及从疾病和损伤中恢复方面发挥着重要作用。自体干细胞给药会增加自体间充质干细胞并将其返回患者体内，不会引起排斥反应。

间充质干细胞的临床应用特点

能够分化成多种类型的细胞

MSCs分离培养时形成单层，表现出一定的表型，但当添加适当的支架和物质，如β-巯基乙醇、表皮生长因子、神经生长因子、脑源性生长因子等神经元分化，它们分化成各种谱系。

• 　1) 中胚层来源的组织，如骨、软骨、血管、脂肪细胞和心肌细胞
• 　2) 外胚层来源的神经元和神经胶质细胞
• 　3) 内胚层来源的肝细胞

细胞因子和营养因子的分泌

据报道，间充质干细胞可分泌多种细胞因子和生长因子。

• 　1) 细胞因子，包括IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14和IL-15
• 　2) 血小板衍生生长因子 (PDGF) 
• 　3）血管内皮生长因子（VEGF）
• 　4) 肝细胞生长因子 (HGF) 
• 　5) 脑源性神经营养因子 (BDNF) 
• 　6) 神经生长因子 (NGF) 
• 　7) 胰岛素样生长因子-1 (IGF1) 
• 　8) 基质衍生生长因子-1 (SDF1) 
• 　9) 粒细胞集落刺激因子 (GCSF) 
• 　10)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF) 。

抗炎作用

在创伤性脑损伤中，静脉注射MSC会减少细胞外部位的小胶质细胞和促炎细胞因子，同时增加抗炎细胞因子。与对照组相比，MSC组脊髓损伤部位的IL-1β和TNF-α显着降低。

保护和修复神经元并促进髓鞘修复（少突胶质细胞保护）

当坐骨神经横断5毫米的大鼠接受MSC治疗时，治疗组中70%的大鼠穿过神经间隙的轴突最大直径百分比达到50%或更高，而对照组为0%。对出生后9天的缺氧缺血性脑损伤大鼠进行治疗，3天后进行MSC治疗，治疗21天后，神经元和少突胶质细胞的损失分别减少了42%和31%。它还改善了功能结果并减少了病变体积，表明最近分裂的细胞向神经元和少突胶质细胞的分化增加，并减少了增殖的炎症细胞。

血管重建

MSC促进血管内皮细胞增殖并抑制细胞凋亡。心肌梗死后1周，将自体MSCs心肌内注射至梗死区，2个月后，VEGF表达水平明显升高，梗死区血管密度和局部血流量增加，肥厚心肌细胞凋亡减少，左心室收缩力明显改善。

肾保护作用

抑制肾炎部位浸润巨噬细胞并诱导免疫调节巨噬细胞。

异常蛋白质的降解

MSC具有脑啡肽酶活性，这是一种降解淀粉样蛋白-β的酶，β淀粉样蛋白是一种沉积在阿尔茨海默病患者大脑中的不溶性蛋白质。重复静脉注射MSC可改善皮肤淀粉样变性。

表1：总结了间充质干细胞在临床应用中有效的证据。

1	分化成多种细胞谱系
2	分泌多种细胞因子和营养因子
3	调节炎症
4	保护和促进神经元和髓鞘的修复
5	改善血液循环
6	保护肾脏
7	降解异常蛋白质，包括β淀粉样蛋白。

此外，正在研究间充质干细胞在组织工程领域的应用。组织工程的目的是通过适当地组合细胞、平台和营养来创建三维人造器官和组织。

使用从MSC分化的细胞进行软骨细胞片治疗软骨损伤的研究已经在进行中。

脂肪组织干细胞的优点

ADSC 可以在局部麻醉下以最小的侵入性从皮下脂肪中收获。据报道，从脂肪组织中获得的MSC比从相同体积的骨髓组织中获得的MSC多约500倍，并且脂肪组织产生更多的生长因子（再生促进因子），例如 HGF和VEGF，这些因子有助于促进细胞再生。比骨髓来源的组织更能修复器官。ADSC比骨髓来源的 ADSC具有更高的免疫调节能力。

间充质干细胞的临床应用

间充质干细胞可以从骨髓或皮下脂肪组织中获取，它们在再生医学中的应用正在增加，因为由于安全和伦理问题较少，它们比ES细胞或iPS细胞更容易应用于临床。

在日本，非自体骨髓间充质干细胞（TemucelⓇHS注射液，JCR Pharma KK）于2015年被批准用于治疗造血干细胞移植后的急性移植物抗宿主病（GVHD），并作为保险使用- 批准治疗急性GVHD患者。

此外，2018年，它被批准用于治疗急性GVHD。

同年，自体骨髓间充质干细胞（StemilacⓇ注射液，镍公司）被批准为治疗创伤性脊髓损伤的再生医学产品，使医疗保险下的治疗成为可能。

在日本，《确保再生医学安全法》（https://www.mhlw.go.jp/english/policy/health-medical/medical-care/dl/150407-01.pdf）于2014年11月与《确保药品和医疗器械等的质量、有效性和安全性的法案》一起实施。旨在促进再生医学的安全和发展。《再生医学安全保障法施行令及临床研究法施行令》的部分修改部令（厚生劳动省令2021年第14号）生效2021年2月1日起生效。

这些法律允许使用干细胞进行再生医学，即使没有被保险覆盖（日本的医疗原则是被保险覆盖，所有公民都有保险），只要经特定再生医学审定委员会等讨论通过后，由厚生劳动省批准。这项治疗研究需要制定方案、为接受治疗的患者准备解释性文件、向患者解释并征得患者同意，并以与临床试验相同的方式处理结果来决定是否进行治疗。申请保险。所有以这种方式批准的治疗和研究都会发布在厚生劳动省的网站上，供任何人查看（https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/0000186471.html）。

在上述法律体系的支持下，目前正在进行数百项治疗研究。据报道，即使对于难以治疗的脊髓损伤，使用 MSC 也可以改善运动和感觉功能障碍。此外，对于阿尔茨海默病、ALS、帕金森病等神经退行性疾病，以及慢性阻塞性肺病和肺纤维化等顽固性肺部疾病，目前尚无治疗方法可以抑制疾病进展，目前正在开展使用重复静脉注射MSCs，尤其是自体ADSCs，治疗效果有望得到验证。

截至2021年8月，病例报告中报告了 ALS患者，该患者在2016年国际外科医生学会 (ICS) 第40届世界大会（10月23-26日）上发表了演讲（议程和摘要第139页Hisakazu Yamagishi）尽管他拄着拐杖行走，但他仍然活着，没有呼吸器或胃造口术。在许多神经退行性疾病中都发现了大脑中异常蛋白质的沉积。间充质干细胞去除这些异常蛋白质的能力，以及修复神经元和髓磷脂的能力，可能为治疗许多神经退行性疾病带来希望，否则这些疾病将是进行性且无法治疗的。

间充质干细胞的临床研究十分活跃，其作用也相继报道。据报道，针对帕金森病反复输注ADSC可改善 MDS-UPDRS，尽管这是一项开放标签的试点研究。双盲随机对照试验通常成本高昂，有时在伦理上具有挑战性，但却是确定临床疗效的黄金标准。如果给予间充质干细胞治疗疾病进展并且症状改善或停止进展，则可以考虑将其效果与不进行治疗所能达到的最佳效果进行比较。即便如此，还需要进一步验证，而且非常值得。

间充质干细胞的施用方法

间充质干细胞可以全身给药而无需移植到靶器官，原因有两个：它们可以在未分化状态下给药，这是iPS细胞或ES 细胞不可能实现的；它们具有独特的功能，允许全身给药的MSC在病变，称为归巢。

MSC归巢被定义为 MSC在组织脉管系统内停滞，然后迁移穿过内皮。当MSCs被静脉注射给脊髓损伤的大鼠时，早在给药后6小时就在受伤区域发现了所注射的细胞，并且直到至少28天后才得到确认。同样，当将分化为少突胶质细胞前体细胞的间充质干细胞静脉注射给脊髓损伤的大鼠时，治疗4周后，约30%的注射细胞在脊髓损伤区域积聚。此时，8%的细胞已经迁移到大脑中。

此时，8%已迁移至大脑，12%迁移至肾脏，7%迁移至肝脏，3%迁移至肺部。

间充质干细胞管理的安全性

尽管MSC通常被认为是安全的，不存在包括畸胎瘤在内的肿瘤，并且几乎没有排斥反应，特别是对于自体干细胞而言，但它们表达组织因子 (TF)，这是一种有效的凝血激活剂。MSC接触血液后会促进血栓前状态，其机制归因于所谓的即时血液介导的炎症反应 (IBMIR) 。间充质干细胞的组织因子表达和促凝血活性根据组织来源（在脂肪中比在骨髓中更是如此）以及培养时间而变化。静脉内MSC存在栓塞风险。由于静脉注射间充质干细胞首先从腔静脉经过右心房和右心室到达肺部，因此必须小心肺栓塞。肺栓塞的风险与施用的细胞数量和施用速率相关。

间充质干细胞，尤其是自体间充质干细胞，被认为是安全的，但由于它们用于治疗的时间相当有限，可能存在未知的副作用。当然，一些入侵，无论多么小，都会在收集时添加。由于骨髓间充质干细胞需要采集骨髓，脂肪干细胞需要采集皮下脂肪组织，因此必须注意此类操作的安全性。尽管不限于干细胞，但培养物中不应存在感染，并且在给予人类时应避免使用异种动物来源的成分。

自体间充质干细胞与同种异体间充质干细胞

施用同种异体间充质干细胞的优点是可以预先收获和培养干细胞，然后在需要治疗时立即施用。这对于治疗不能等待干细胞培养期的急性疾病（例如Covid-19）尤其重要。

另一方面，关于同种异体MSC治疗后的免疫抑制状态，据报道巨细胞病毒抗原血症的频率增加(67)和肺炎相关死亡的增加。给予同种异体MSC后，需要针对侵袭性真菌感染等传染病采取充分的对策。有报道称发生 EB 病毒相关的移植后淋巴组织增生性疾病以及EB病毒血症。

由于自体间充质干细胞具有多种功效，并且不存在伦理问题和排斥反应，因此它们将继续发展为一种有吸引力的治疗方法，并且哪种给药方法最好、给药的最佳细胞数量将变得更加清楚，施用的次数和施用的持续时间，例如重复施用应当持续多长时间。如果弄清楚哪种疾病可以通过哪种作用机制得到改善，适应症的范围将会扩大，并且可能导致对病因尚不清楚的疾病的原因进行调查。

结论

间充质干细胞在再生医学中的潜力是巨大的，它们对哪些疾病起作用以及作用程度如何，但其作用机制和具体给药方法将在未来得到阐明。除了分化成特定细胞的能力外，间充质干细胞还能够分泌各种生长因子和细胞因子，从组织中清除异常蛋白沉积物，并在疾病部位积聚，这一特性称为归巢。相信MSC疗法将为一些目前尚无根本治疗方法的疑难杂症的治疗带来一线希望，有望惠及此类疾病患者。

参考资料：Yamagishi H, Shigematsu K. Perspectives on Stem Cell-Based Regenerative Medicine with a Particular Emphasis on Mesenchymal Stem Cell Therapy. JMA J. 2022;5(1):36-43.

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