前言：由于成年哺乳动物大脑的自我修复和再生能力有限，以不可逆的细胞损伤为特征的神经系统疾病，特别是神经退行性疾病和中风，通常被认为是难治性疾病。神经干细胞（NSC）因其自我更新和形成不同神经谱系细胞（如神经元和神经胶质细胞）的能力，在神经系统疾病的治疗中发挥着独特的作用。随着对神经发育认识的不断深入和干细胞技术的进步，可以从不同来源获得神经干细胞，并定向分化为特定的神经谱系细胞表型，使得替代某些神经系统疾病中丢失的特定细胞成为可能，这提供了新的途径。
近日，华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科联合武汉大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室对神经干细胞移植治疗神经退行性疾病和缺血性中风进行了新研究，研究结果发表在《自然》子刊cell death discovery上，文章证实了
- 不同来源的神经干细胞可以在体外被诱导分化为成熟且有功能的神经元或神经胶质细胞。
- 移植预分化神经干细胞可以分化成熟为特定类型的细胞，促进神经退行性疾病或中风模型的恢复。
- 目前，来自人类胚胎干细胞的多巴胺能神经元经过神经干细胞阶段，正在帕金森病患者的临床试验中进行测试。
在这篇文章中，我们概述了从不同来源的神经干细胞生成几种神经元谱系亚型的进展。我们进一步总结了这些特定的神经干细胞在神经系统疾病模型中的治疗效果和可能的治疗机制，特别是帕金森病和缺血性中风。最后，我们从临床转化的角度，比较了不同来源的NSCs和不同定向分化方法的优缺点，并提出了NSCs定向分化在再生医学中的未来研究方向。
开放式问题
- 对于神经退行性疾病或中风，哪种神经干细胞来源和哪种定向分化方法将使移植细胞符合良好生产规范指南？
- 移植神经干细胞分化的最佳时间窗是多少？
- 移植的预分化神经干细胞的细胞替代的潜在机制是什么？
什么是神经退行性疾病？
神经退行性疾病 (ND) 是一组异质性疾病，其特征是神经元进行性和选择性丧失，导致感觉丧失、运动和记忆障碍，以帕金森病 (PD)、亨廷顿舞蹈病 (HD)、肌萎缩侧索硬化症（ALS）和多发性硬化症（MS）为代表。缺血性中风是最常见的中风类型，由于流向大脑部分的血流减少，导致缺血核心的神经元和非神经元死亡。如果有足够的时间，缺血半暗带中组织功能的可逆性丧失可能是永久性的。这些疾病直接威胁患者的生命，给家庭和社会带来沉重的经济负担。然而，目前针对这些疾病的治疗方法并不具有治愈性且相对有限，大多数只能缓解症状并延缓病程。
神经修复与再生治疗是治疗神经系统疾病的理想方法。这方面已经做了大量的工作，主要是从内源性和外源性两个方面来促进神经修复和再生。神经干细胞 (NSC) 是一类多能细胞，其定义是基于其强大的自我更新能力和分化成各种中枢神经系统 (CNS) 神经元和神经胶质细胞类型的能力。NSC介导的内源性神经发生已在多种病理状况中得到证实，例如癫痫、多发性硬化症、缺血性中风和AD，但仅靠内源修复是不够的。
神经干细胞移植策略作为再生医学的一种，在NDs的治疗中受到越来越多的关注。此外，随着干细胞领域的进步，用于移植的NSCs来源已从最初的直接分离脑组织扩展到多能干细胞（PSCs）的分化和体细胞的转分化。迄今为止，基于NSC的疗法已在许多ND和缺血性中风的啮齿动物模型中实施，并且一些研究提出了解释NSC改善疾病作用的潜在机制，包括神经炎症抑制、神经元替代、免疫调节和神经营养支持，从而促进ND和中风模型的恢复。
然而，直接移植的神经干细胞不可忽视的挑战是低存活率和不合理的分化。在ND和缺血性中风中，可以观察到CNS中先天免疫细胞的慢性或急性激活。神经炎症反应诱导的宿主微环境可能在移植的神经干细胞的存活和分化中发挥关键作用。此外，参与炎症途径的自噬已被证明可以调节移植的NSC的分化。
为了克服直接移植NSCs的局限性，并考虑到某些ND中特定细胞类型丢失的病理特征，人们致力于探索移植前操纵NSCs命运以控制终末谱系以替代NSCs的可行性。目前，通过使用化学定义系统或关键谱系特异性转录因子的异位过度表达，不同来源的神经干细胞可以在体外定向分化为特定类型的神经谱系细胞，如DAergic神经元、GABAergic神经元、胆碱能运动神经元、少突胶质细胞、谷氨酸能神经元。随后的研究进行了预分化细胞的体内移植，以研究其在神经系统疾病中的治疗作用（图1）。
不同来源神经干细胞体外定向分化
目前，NSCs可通过三种不同方式获得：直接从原始中枢神经系统组织中提取、PSCs分化和体细胞转分化（图2）。
NSCs存在于整个发育中的大脑。在成年哺乳动物脑中，NSCs可见于海马颗粒下区、室管膜下区，甚至整个脑室系统的多个部位。包括胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)在内的PSCs可通过两种主要方法在体外诱导分化为NSCs：类胚体(EB)形成和粘附单层培养。
具体来说，PSCs的神经分化过程是多步骤的，首先通过去除促进自我更新的介质，引发向胚胎三个胚层的分化，随后通过在无血清培养基中培养细胞，抑制胚外和中胚层分化，促进神经分化。此外，同时抑制转化生长因子β和BMP信号通路的双重SMAD抑制可减少培养变异性，提高神经诱导的效率。
此外，PSCs的神经诱导还可以通过与基质细胞饲养层的共培养来实现，这可以为限制PSCs向神经系的命运提供线索。诱导的NSCs可以直接从体细胞，如外周血单核细胞（PBMNCs）、成纤维细胞和其他类型的细胞重新编程。不同来源的NSCs可被诱导分化为所需的神经系细胞。
目前，NSCs可通过三种途径获得：1）从原代中枢神经系统组织中分离，主要包括成人和胎儿的脑组织；2）通过EB形成或单层培养从多能干细胞（iPSC和ESC）分化，双重SMAD抑制可以促进神经诱导过程；3）由体细胞转分化，如血细胞和成纤维细胞。CNS中枢神经系统、EB胚状体、ESC胚胎干细胞、IPSC诱导多能干细胞。
了解神经系统的自然发育对于操纵NSC的定向分化至关重要。到目前为止，已开发出两种主要的诱导分化方法：化学限定系统和内在转录因子介导的方法，通过它可以产生所需的神经谱系细胞类型，例如DAergic神经元、MSN、胆碱能运动神经元、少突胶质细胞和皮质谷氨酰胺能神经元（图3）。
神经干细胞诱导定向分化在神经系统疾病模型中的治疗潜力
目前涉及的主要神经疾病模型包括PD、HD、MS、ALS和缺血性中风。在这里，我们主要概述了NSCs衍生的特定表型在慢性神经退行性疾病PD和急性神经退行性缺血性中风中的治疗潜力。
帕金森病
帕金森病（PD）是一种进行性神经退行性疾病，病理特征是黑质紧密层的DA能神经元变性，随后支配纹状体的DA能轴突末梢丢失，导致运动障碍。目前，PD的主要治疗方法是多巴胺替代疗法。然而，它只能缓解PD的症状而不能延缓PD的进展。关于体外靶向分化VM DAergic神经元的成功，一些研究已将这些细胞移植到不同的PD模型中，以观察它们在行为、细胞和分子水平上的治疗效果。
上述大多数研究将预分化的NSC植入6-OHDA或MPTP诱导的PD模型的纹状体中，导致感觉运动改善，例如自发活动增加和转圈行为减少。考虑到放置在黑质中的VM组织移植物无法将轴突延伸足够长以到达其目标区域纹状体以形成复杂的神经回路，因此考虑异位植入。植入后，其中一些经过预处理的NSC可以在PD动物模型中存活，并表现出黑质DAergic神经元的表型，多巴胺水平增加。
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因此，目前的研究表明，异位和同位移植的VMDA神经元都可以进行突触前和突触后整合，并且很自然地假设重建的功能性黑质-纹状体回路导致PD模型中的运动恢复。
除了移植位置，DA能神经元分化的最佳移植时间窗对黑质-纹状体回路的重建也很重要。以VM组织为供体，移植时供体细胞的成熟度显著影响移植物的组成和功能结果。具体来说，在DA神经发生高峰期（胚胎第12天）之前分离的供体组织在移植物中产生更多的DA能神经元，这归因于植入时DA神经母细胞存活和增殖增加。
缺血性中风
缺血性卒中是一种脑血管事件，虽然不属于神经退行性疾病，但在梗死区也会 出现病理性细胞死亡，包括不同类型的神经元和神经胶质细胞。近年来，缺血性卒中的有限治疗包括血管内手术（称为血栓切除）或静脉注射阿替普酶（称为溶栓）以恢复血流。然而，由于治疗窗狭窄、一些禁忌症、溶栓再通大动脉的疗效低，甚至再通后存在 再灌注损伤，只有一小部分缺血性患者能从这两种治疗中获益。可能是受NDs丢失的特定细胞替代疗法的启发，最近有研究针对缺血性卒中丢失的不同细胞类型移植特定细胞进行替代，以重建受损的神经回路。
一项临床和影像学研究显示，卒中患者症状最严重时受损细胞的分布往往不在纹状体，提示细胞替代策略应强调重建受损皮层而非纹状体。因此，一些研究将来源于PSCs的具有皮质谷氨酸能表型的祖细胞植入缺血性卒中大鼠模型的皮质，发现这些细胞可以缓解移植后2个月或6个月的感觉运动障碍。移植后2个月的早期行为改善很可能不是神经元替代和电路整合的结果。
徐等人提出了一个两步方案，从iPSC中稳定快速地衍生NG2阳性OPC，首先抑制SHH生成NPC，然后过表达Olig2。将OPCs移植到缺血大鼠的脑室后，发现这些细胞可以通过抑制炎症和免疫反应来保护宿主神经元在缺血环境下免于死亡。此外，这些细胞通过促进缺血性中风大鼠的髓鞘再生过程，在一定程度上挽救了学习和记忆丧失。
讨论和未来方向
根据对细胞移植的大量研究，可以推断，移植前的历史和供体细胞的来源都是影响移植结果的关键因素。
还需要考虑用于产生特定神经元谱系表型的原代中枢神经系统组织和细胞类型的选择，因为它可能会影响神经元谱系分化的效率和移植的有效性。原代中枢神经系统组织来源的NSC的潜力因获得它们的发育阶段和分离地点而异。例如，在相同的培养条件下，来自腹侧中脑的 NSC比来自纹状体的NSC产生更多的DAergic神经元，并且在神经发育过程中A9神经元比A10神经元更早产生，因此早期VM衍生的NSC更有利于A9DAergic神经元的生成。
与组织源性NSC或ESC相比，iPSC和iNSC不受伦理问题的影响。此外，与PSC移植物相比，源自人iNSC的神经移植物在移植后不太可能产生快速生长的肿瘤。目前，正在积极采取多种策略来解决各种来源的移植细胞潜在病理性生长的可能性，例如在移植前使用细胞分选技术去除脱靶污染细胞类型或转导配体激活的自杀基因以消除体内增殖细胞。近年来随着诱导神经元（iN）技术的快速发展，直接对体细胞进行重编程获得功能性神经元成为可能。然而，iN方法将体细胞直接转化为非分裂神经元，而不是命运定型的神经元祖细胞，并且这些非分裂神经元在移植后往往在宿主大脑中存活和整合不良。
此外，供体细胞移植前应充分考虑不同神经系统疾病的特殊病理状态，这可能在一定程度上影响细胞移植策略。在神经退行性疾病中，细胞替代的结果取决于需要恢复的连接模式的复杂性和精确性。在帕金森病的病例中，只有部分模式修复才能导致显著的功能恢复。DA能细胞的异位移植，也被称为旁分泌策略，可以恢复多巴胺的有效释放，从而调节黑质纹状体回路。目前，基于纳米技术、分子生物学和成像技术的进步，移植细胞追踪技术已经从体外检测转向体内成像，进一步结合病毒或基因标记策略，可以帮助研究者探索移植细胞与宿主脑之间的突触联系。
除了移植定向诱导的神经干细胞外，体内细胞重编程、神经胶质细胞原位转化为功能性新神经元也是一种有前景的神经再生策略。此外，移植的外源干细胞可通过基因工程稳定地产生生长因子，支持修复功能障碍的内源性神经元。例如，人iPSC衍生的神经祖细胞经基因工程改造后可稳定产生GDNF，移植后可释放GDNF，保护PD模型和ALS模型中的变性神经元。因此，研究人员以不同的方式投入了大量精力，以实现相同的目标：促进神经修复或再生。
最近的临床前研究已经证明了源自PSCs的DA能神经元的安全性和有效性。基于这些充满希望的结果，各国正在开展临床试验。PD临床试验为其他衍生神经系细胞进入这些未知领域提供了重要的指导，我们相信在不久的将来，从不同来源的NSCs，特别是PSCs衍生的神经系细胞将在临床试验中进行测试，以开发相关神经系统疾病的治疗方法。
参考资料：Nie, L., Yao, D., Chen, S. et al. Directional induction of neural stem cells, a new therapy for neurodegenerative diseases and ischemic stroke. Cell Death Discov. 9, 215 (2023). https://doi.org/10.1038/s41420-023-01532-9
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