目录
- 中枢神经系统
- 神经干细胞的鉴定
- 体内神经干细胞的功能
- 神经干细胞的培养系统
- 神经干细胞的分离策略
- 脑肿瘤干细胞
- 摘要
中枢神经系统
成熟的哺乳动物中枢神经系统(CNS)由三大分化细胞类型组成:神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经元通过动作电位和神经递质向其他神经元、肌肉细胞或腺细胞传递信息。星形胶质细胞和少突胶质细胞统称为胶质细胞,除了为神经元的最佳功能和存活提供重要的支持作用外,它们自身也发挥着重要作用。
在哺乳动物胚胎发育过程中,中枢神经系统的发育始于神经外胚层的诱导,神经外胚层形成神经板,然后折叠形成神经管。在这些神经结构中,存在着复杂而异质的神经上皮祖细胞(NEP)群体,这是最早形成的神经干细胞类型。在神经发育的早期阶段,NEPs经历对称分裂以扩大神经干细胞池。在神经发育的后期阶段,神经干细胞转入非对称分裂周期,并产生受系限制的祖细胞。中间神经元祖细胞首先形成,随后分化生成神经元。在这一神经源阶段之后,NSCs经过不对称分裂,产生神经胶质限制性祖细胞,进而生成星形胶质细胞和少突胶质细胞。中枢神经系统发育的后期包括轴突修剪和神经元凋亡期,这对中枢神经系统的回路进行了微调。
以前有一种长期存在的教条认为,成年哺乳动物中枢神经系统中的神经发生是完全的,使其无法进行有丝分裂以生成新的神经元,因此缺乏修复因疾病(如帕金森病、多发性硬化症)或损伤(如脊髓和脑缺血损伤)造成的受损组织的能力。然而,现在有确凿证据表明,在成熟的哺乳动物中枢神经系统中确实存在多能性间充质干细胞,尽管它们只存在于特殊的微环境中。这一发现推动了一个新时代的研究,即了解这些细胞在治疗中枢神经系统疾病和损伤方面的巨大潜力。
神经干细胞的鉴定
神经生物学家通常交替使用各种术语来描述中枢神经系统的未分化细胞。最常用的术语是“干细胞”、“前体细胞”和“祖细胞”。不恰当地使用这些术语来识别中枢神经系统中的未分化细胞,导致了神经干细胞和神经祖细胞研究领域的混乱和误解。然而,中枢神经系统中这些不同类型的未分化细胞在技术上具有不同的特征和命运。为了清楚起见,这里使用的术语是:
- 神经干细胞(NSC):能够自我更新和无限制增殖的多能细胞,产生最终分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的子代细胞。NSC 的非干细胞后代被称为神经祖细胞。
- 神经祖细胞:神经祖细胞具有增殖和分化成多种细胞类型的能力。因此,神经祖细胞可以是单能的、双能的或多能的。神经祖细胞的一个显着特征是,与干细胞不同,它的增殖能力有限并且不表现出自我更新。
- 神经前体细胞(NPC):此处使用的是指由神经干细胞的所有未分化子代组成的混合细胞群,因此包括神经祖细胞和神经干细胞。神经前体细胞一词通常用于统称源自胚胎干细胞和诱导多能干细胞的神经干细胞和神经祖细胞的混合群体。
1992年之前,大量报告证明了在生长因子存在下从胚胎组织分离的神经祖细胞的神经发生和体外增殖有限的证据。3-5虽然已在成人中枢神经系统中鉴定出多个神经祖细胞亚群,但研究人员无法令人信服地证明干细胞的特征,即自我更新、延长的增殖能力和多谱系潜力的保留。体内研究支持增殖发生在生命早期的观点,而成人中枢神经系统有丝分裂不活跃,并且在受伤后无法产生新细胞。
值得注意的例外包括20世纪60年代的几项研究,这些研究清楚地确定了成人大脑中表现出增殖的区域(前脑室管膜下)6,但人们认为这是物种特异性的,并且不认为存在于所有哺乳动物中。20世纪90年代初,从胚胎和成体中枢神经系统中分离出对特定生长因子有反应并在体外表现出干细胞特征的细胞。
7-8通过这些研究,Reynolds和Weiss证明,成人CNS中的罕见细胞群表现出干细胞的定义特征:自我更新、产生大量后代的能力和多谱系潜力。后来确定干细胞在成人大脑中的位置位于纹状体内,9研究人员开始表明,从该区域以及成人大脑侧脑室的背外侧区域分离的细胞能够分化为两者神经元和神经胶质细胞。10
神经干细胞在体内的功能
在哺乳动物中枢神经系统发育过程中,从神经管产生的神经前体细胞产生多能和更受限的神经祖细胞库,然后增殖、迁移并进一步分化为神经元和神经胶质细胞。在胚胎发生过程中,神经前体细胞源自神经外胚层,并且可以在神经板和神经管形成过程中首先被检测到。随着胚胎的发育,在胚胎小鼠、大鼠和人类中枢神经系统的几乎所有区域都可以识别出神经干细胞,包括隔膜、皮质、丘脑、腹侧中脑和脊髓。从这些区域分离的NSC具有独特的空间特性和分化潜力。
与发育中的神经系统相比,神经系统相当普遍,具有“神经干细胞”特征的细胞主要定位于成熟中枢神经系统的两个关键区域:室下区(SVZ),内衬前脑侧脑室,和海马结构齿状回的颗粒下层(稍后描述)。11
在成年小鼠大脑中,SVZ含有异质的增殖细胞群。然而,人们相信B型细胞(激活的GFAP+/PAX6+星形胶质细胞或星形胶质细胞样NSC)是表现出干细胞特性的细胞,并且这些细胞可能直接源自放射状胶质细胞,放射状胶质细胞是神经系统中主要的神经前体群体。早期发育的大脑。该生态位中的NPC在正常生理条件下相对静止,但在照射后可被诱导增殖并重新填充SVZ。
10室下区神经干细胞通过产生快速分裂的转运放大祖细胞(TAP或C细胞)维持整个成年期的神经发生,然后分化并产生神经母细胞。TAP和神经母细胞通过头端迁移流 (RMS) 迁移,并进一步分化为嗅球中的新中间神经元。这种持续的神经发生得到了SVZ中NSC的支持,对于维持嗅觉系统至关重要,为啮齿类动物的嗅球和非人类灵长类动物的联合皮层提供了新的神经元来源。12尽管成人大脑中的RMS一直难以捉摸,但也观察到神经母细胞通过RMS进行类似的迁移。13
神经发生也持续存在于海马体的颗粒下区,该区域对于学习和记忆很重要,导致新颗粒细胞的产生。谱系追踪研究已将神经祖细胞定位到海马背侧区域,即齿状回内塌陷的脑室中。
10研究表明,来自颗粒下层的神经源性细胞的增殖潜力可能比室下区神经干细胞更有限,并且比真正的干细胞更有可能是祖细胞。14最近的证据还表明,神经发生在海马体中与嗅球中发挥着不同的作用。虽然室下区神经干细胞发挥维持作用,但人们认为海马神经发生有助于增加新神经元的数量,并有助于海马在整个成年过程中的生长。12
神经祖细胞也在脊髓中央管脑室区和软脑膜边界15-16中被鉴定出来,并且将来可能会鉴定出更多的区域祖细胞群。
中科神经干细胞培养系统
旨在分离、扩展和功能表征NSC群体的体外方法彻底改变了我们对神经干细胞生物学的理解,并增加了我们对NSC遗传和表观遗传调控的了解。17在过去的几十年里,人们开发了许多培养系统,试图重现神经系统不同的体内发育阶段,从而能够隔离和扩展处于不同发育阶段的不同NPC群体。在这里,我们概述了从多能干细胞 (PSC) 生成NPC,以及从早期胚胎、出生后和成人CNS中分离和扩增NSC的常用培养系统。
多能干细胞的神经诱导和分化
早期NPC可源自小鼠和人类PSC,其中包括胚胎干细胞 (ESC) 和诱导多能干细胞 (iPSC),在分化的第一阶段使用适当的神经诱导条件。虽然这些神经分化方案差异很大,但流行的基于胚体的方案的一个显着特征是生成神经“玫瑰花结”,即包含NPC的形态可识别结构,据信代表神经管。然后,神经花结结构中存在的 NPC被分离出来,并且可以繁殖以允许NPC扩张,同时保持生成神经元和神经胶质细胞的潜力。
最近的研究表明,PSC的神经诱导也可以在单层培养系统中实现,其中将人ESC和iPSC铺在特定的基质上,并暴露于诱导因子。18特定细胞因子或小分子的组合被认为可以模拟胚胎发生过程中大脑发育时空模式的发育线索,可以在神经诱导阶段将其添加到培养物中,以促进NPC的区域化。然后,这些“模式化”的NPC 可以分化为具有代表大脑不同区域表型的成熟细胞类型。19-24已开发出新方案,可从PSC衍生的神经祖细胞生成脑类器官。大脑类器官概括了人类大脑发育的特征,包括形成具有特征性层状细胞组织的离散大脑区域。25
神经球培养
神经球培养系统自开发以来作为一种识别神经干细胞的方法已被广泛使用。26-29对中枢神经系统的特定区域进行显微解剖、机械或酶解,并在有丝分裂因子(如表皮生长因子 (EGF) 和/或碱性成纤维细胞生长因子)存在下铺在确定的无血清培养基中bFGF)。
在神经球培养系统中,NSC以及神经祖细胞响应这些有丝分裂原而开始增殖,2-3天后形成小细胞簇。簇的尺寸继续增大,到第3-5天,大多数簇从培养物表面分离并开始在悬浮液中生长。大约第七天,根据细胞来源,细胞簇(称为神经球)的直径通常为100-200μm,由大约10,000-100,000个细胞组成。
此时,应该对神经球进行传代,以防止细胞簇生长太大,否则会因神经球中心缺乏氧气和营养交换而导致坏死。为了传代培养物,将神经球单独或作为群体机械或酶解成单细胞悬浮液,并在与原代培养物相同的条件下重新铺板。NSC和神经祖细胞再次开始增殖,形成新的细胞簇,并在大约5-7天后准备传代。
通过重复上述过程进行多次传代,培养物中存在的NSC将自我更新并产生大量后代,导致细胞总数随着时间的推移相对一致地增加。以这种方式处理的来自胚胎小鼠中枢神经系统组织的神经球可以传代长达10周,而其增殖能力不会丧失,从而导致总细胞数量增加100倍以上。在低血清培养基存在下,通过去除有丝分裂原并将完整的神经球或解离的细胞铺在粘附基质上,可以诱导NSC和神经祖细胞分化。
几天后,几乎所有的神经干细胞和后代都会分化成中枢神经系统中发现的三种主要神经细胞类型:神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。虽然培养基、生长因子要求和培养方案可能有所不同,但神经球培养系统已成功用于从许多物种(包括小鼠、大鼠和人类)的胚胎和成体CNS的不同区域分离NSC和祖细胞。
贴壁单层培养
或者,从CNS组织获得的细胞可以在补充有EGF和/或bFGF的成分确定的无血清培养基中,在底物如聚-L-鸟氨酸、层粘连蛋白或纤连蛋白的存在下作为贴壁培养物进行培养。当在这些条件下铺板时,神经干细胞和祖细胞将附着在基底包被的培养皿上,而不是彼此相反,形成粘附的单层细胞,而不是神经球。据报道,在长期贴壁单层培养物中扩增NSC的成功率各不相同,可能是由于所用底物、无血清培养基和生长因子的差异所致。
17最近,采用层粘连蛋白作为底物以及含有EGF和bFGF的适当无血清培养基的方案已能够支持小鼠和人类CNS组织的神经前体细胞的长期培养。30-32这些贴壁细胞在5-10天内增殖并融合。为了传代培养物,通过酶处理将细胞从表面分离,并在与原代培养物相同的条件下重新铺板。据报道,在贴壁单层条件下培养的神经干细胞在长期培养中会发生对称分裂。30,33与神经球培养系统类似,贴壁培养的细胞可以传代多次,并在去除有丝分裂原并暴露于低血清培养基后诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
几项研究表明,在神经球培养物中培养CNS细胞并不能有效维持NSC并产生异质细胞群,而在无血清贴壁培养条件下培养细胞确实可以维持NSC。17虽然这些报告没有直接比较使用相同培养基、生长因子或细胞外基质的神经球和贴壁单层培养方法来评估NSC数量、增殖和分化潜力,但他们强调培养系统可以影响 NSC和神经干细胞的体外功能特性。重要的是,NSC研究的体外方法在设计时要考虑到这一警告,并清楚地了解这些方法旨在测量的内容。34-35
中科神经干细胞的分离策略
使用针对干细胞、祖细胞和成熟CNS细胞上存在的细胞表面标记物的抗体的免疫磁性或免疫荧光细胞分离策略已应用于NSC的研究。
与其他系统的干细胞类似,中枢神经系统干细胞的表型尚未完全确定。CD34、CD133和CD45抗原的表达或缺乏表达已被用作潜在CNS干细胞亚群初步表征的策略。具有表型CD133+5E12+CD34–CD45–CD24-/lo的人类胎儿CNS细胞的独特子集能够在培养物中形成神经球、启动次级神经球形成并分化为神经元和星形胶质细胞。
36使用类似的方法,基于荧光激活细胞分选 (FACS)从成年小鼠脑室周围区域分离巢蛋白+PNA–CD24–细胞,使NSC显着富集(分选群体中的频率为80%,代表增加了100倍)来自未分类的群体)。37然而,当使用更严格的神经集落形成细胞 (NCFC) 测定重新评估该策略时,发现富集的NSC群体的纯度较低。
在中枢神经系统发育的不同阶段检测到的38-39NSC子集已被证明表达标记物,例如巢蛋白、GFAP、CD15、Sox2、Musashi、CD133、EGFR、Pax6、FABP7 (BLBP) 和GLAST40-45。然而,这些标记物都不是 NSC 特有表达的;许多也由神经祖细胞和其他非神经细胞类型表达。研究表明,多种组织中的干细胞,包括骨髓、骨骼肌和胎儿肝脏,可以通过其流出荧光染料(如 Hoechst 33342)的能力来识别。这样的群体,称为“侧群体”,或SP(基于其在流式细胞仪上的分析),也在小鼠原代中枢神经系统细胞和培养的神经球中得到了鉴定。
46其他非免疫学方法已用于根据干细胞的一些体外特性(包括FABP7表达和高乙醛脱氢酶 (ALDH) 酶活性)来识别来自正常和致瘤中枢神经系统组织的细胞群。来自胚胎大鼠和小鼠中枢神经系统的 ALDH-bright 细胞已被分离出来,并被证明具有在体外产生神经球、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力,以及当移植到成年小鼠大脑皮层时在体内产生神经元的能力。47-50
脑肿瘤干细胞
多能神经干细胞样细胞,称为脑肿瘤干细胞 (BTSC) 或癌症干细胞 (CSC),已从不同级别(低级和高级)和类型的脑癌(包括神经胶质瘤和髓母细胞瘤)中鉴定和分离。51-52与NSC类似,这些BTSC在体外表现出自我更新、高增殖能力和多谱系分化潜力。他们还在免疫功能低下的小鼠中启动了与母体肿瘤表型相似的肿瘤。53尚未发现 BTSC 的独特标记,但最近的研究表明肿瘤包含异质细胞群,其中一部分细胞表达推定的 NSC标记CD133。从原发性肿瘤样品中纯化的53CD133+细胞在注射到原发性免疫功能低下的小鼠中时形成原发性肿瘤,并且在连续移植到继发性受体小鼠中时形成继发性肿瘤。53然而,CD133也由不同组织中的分化细胞表达,并且 CD133 – BTSC 也可以在免疫功能低下的小鼠中引发肿瘤。54-55因此,CD133单独使用或与其他标志物联合使用是否可用于区分不同级别和类型的脑肿瘤中的肿瘤起始细胞和非肿瘤起始细胞仍有待确定。最近,FABP7作为NSC和BTSC的CNS特异性标记物而受到关注。42-43, 57
神经球和贴壁单层培养方法均已应用于BTSC的研究。当培养正常NSC时,需要有丝分裂原EGF(和/或bFGF )来维持NSC增殖。然而,有一些迹象表明,培养BTSC时不需要这些有丝分裂原。57有趣的是,神经球测定可能是BTSC研究的临床相关功能读数,新出现的证据表明,可再生神经球形成是培养的人类神经胶质瘤样本中患者死亡风险增加和肿瘤快速进展的重要预测因素。58-60此外,贴壁单层培养已被证明能够使胶质瘤来源的BTSC纯群体在体外扩增。61
概括
NSC生物学领域的研究在过去约30年中取得了重大飞跃。与上个世纪的看法相反,成年哺乳动物大脑保留了少量位于特定中枢神经系统区域的真正的神经干细胞。中枢神经系统驻留NSC的鉴定以及来自小鼠和人类的成体细胞可以被重编程为多能状态62-68然后定向分化为神经细胞类型的发现,为旨在替代神经细胞的新治疗途径打开了大门中枢神经系统细胞丢失或损坏。这可能包括移植源自胎儿或成人中枢神经系统组织的神经祖细胞或多能干细胞。
最近的研究表明,使用适当的转录因子,可以直接将成体体细胞重新编程为特定的细胞命运,例如神经元,从而绕过对诱导多能干细胞中间体的需要。69通过强制表达单一转录因子(如 Pax6 或前神经转录因子神经原蛋白-2 (Neurog2)),来自出生后早期大脑皮层的星形胶质细胞可在体外重新编程为能够发出动作电位的神经元。70为了开发治疗中枢神经系统损伤和疾病的细胞疗法,需要更深入地了解神经干细胞和祖细胞的细胞和分子特性。
总结:随着神经干细胞:鉴定、功能、培养和分离的机制原理渐渐清晰,同时也为众多神经系统疾病患者带来了曙光,也再次验证了神经干细胞移植,在改善帕金森、自闭症、精神疾病、阿尔茨海默病等方面的临床应用价值。小编也希望未来神经干细胞移植能在我国上市,以造福更多的患者。如果您也饱受帕金森、自闭症、失眠等疾病困扰,且经济条件允许的情况下,可以提交近期检查结果、病历等资料,到杭吉干细胞科技服务中心,进行初步评估。
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