间充质干细胞治疗糖尿病的潜力

• 文章概述：间充质干细胞 (MSC) 是自我更新的多能细胞，能够分泌多种生物因子，恢复和修复受损组织。临床前和临床证据证实了MSCs在各种医疗条件下的治疗益处。目前，MSCs是临床试验中最常用的基于细胞的疗法，因为它们具有再生作用、易于分离和低免疫原性。实验和临床研究已经提供了使用MSCs治疗糖尿病的有希望的结果。这篇综述将总结MSCs在组织修复中的作用，提供改善MSC功能的新兴策略，并描述这些过程如何转化为糖尿病的临床治疗。

介绍

干细胞生物学的进步见证了一个令人兴奋的新研究领域的兴起，即再生医学。再生医学是转化研究的多学科分支，旨在修复受损组织以恢复正常的细胞功能。迄今为止，临床试验中最常研究的细胞群包括间充质干细胞/基质细胞 (MSC)。间充质干细胞的治疗潜力基于它们易于分离、分化成多种细胞类型的能力、低免疫原性以及最重要的是它们释放的生物因子显示可以减轻受损组织。

MSC是起源于中胚层的多能细胞，其特征是：(i) 粘附塑料并自我更新，(ii) 表达特定的表面抗原标记（CD73、CD90、CD105），以及 (iii) 至少具有以下能力：分化成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞。

MSC在体内广泛分布，因此可以从多种来源分离，包括骨髓、心脏、体液、皮肤和围产期组织。MSC通过释放已知可再生受损细胞和组织的免疫调节和营养因子来对微环境变化（pH值、氧气、压力）做出反应。神经退行性和心血管疾病的实验结果支持了基于细胞的研究的快速发展。迄今为止，美国有695项临床试验正在测试MSC作为一系列医学病症的治疗剂的效用。

本综述的目的是对现有文献进行简要总结，评估MSCs作为糖尿病的新型治疗药物。此外，这篇重点综述将讨论最近用于增强干细胞性能的方法，以及这些发现如何转化为内分泌研究。

间充质干细胞的可用和可再生资源

2012年，山中伸弥因发现成熟细胞可以重编程为多能细胞而成为诺贝尔生理学或医学奖的获得者之一。这种非凡的技术是一种优秀且易于获得的自体干细胞来源，可克服细胞/组织排斥问题。骨髓和脂肪组织是 MSC的另一个来源，但它们的缺点是需要侵入性仪器来收集组织。

一种以非侵入性、道德上合理的方式回收MSC的新兴方法，传统上被认为是医疗废物，包括胎盘和/或脐带。此外，与其他MSC组织来源相比，来自这些新生组织的细胞被假定具有更高的增殖和分化能力，以及更高的表达旁分泌因子的能力。在美国，疾病控制和预防中心每年大约有400万例出生和250万例死亡，这导致围产期组织中的MSCs过剩。

从人脐带中分离间充质干细胞

研究表明，可以从脐带血和沃顿氏胶（脐带基质）中分离、扩增和冷冻保存MSC。然而，从沃顿氏果冻 (WJ) 中分离MSC的优势包括：更高的产量、更同质的干细胞群、增加成功分离MSC的可能性以及更好的分化为胰岛素生成细胞的能力。已经描述了几种用于分离WJ-MSC的技术，但是两种最常见的方法包括脐带组织的酶消化或外植体培养方法（图1）。

酶解法

在这种方法中，脐带WJ组织暴露于破坏胶原蛋白基质的酶，从而将细胞释放到下面的溶液中。然后将溶液收集到锥形管中，离心以将沉淀（细胞）与悬浮液分离。去除上清液并将细胞接种在具有干细胞培养基的组织培养皿中。胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶和分散酶是用于从基质中分离WJ-MSC的酶的例子。

外植法

这种方法下的MSC的衍生依赖于将解剖的脐带组织碎片直接转移到组织培养皿上。培养皿中充满了刺激干细胞繁殖的培养基。WJ脐带组织与培养皿底部的粘附允许干细胞从脐带迁移到培养皿的表面。在第一周内，细胞明显粘附在塑料培养皿的表面，此时可以去除组织。

虽然这种技术很简单并且对脐带组织的操作较少，但许多研究人员认为，与酶促方法相比，这种方案会导致细胞达到汇合的时间更长。

间充质干细胞的流式细胞术表征

在37°C、5%CO₂的加湿培养箱中使用干细胞培养基培养细胞后，国际细胞治疗协会指出，细胞必须表达特定的细胞表面抗原标记才能满足MSC的定义。来自脐带的间充质细胞应表达CD73、CD90和CD105的 ≥95%。此外，MSC应表达CD14或CD11b、CD34、CD45、CD19或CD79α或HLA-DR的≤2% ，因为它们是造血分化的标志物。

将间充质干细胞分化为脂肪、骨骼和软骨

MSCs因其多向分化潜力而被理想化，并已被证明能够持续分化为至少三种专门的细胞类型——软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞。

其他文章报道了MSC成功分化为产生胰岛素的细胞、雪旺细胞和神经元。图2描绘了一个WJ-MSC，它粘附在塑料上，表达MSC表面抗原，它也已经分化成三种细胞类型。

(A) 人脐带的横截面。(B) WJ-MSCs成纤维细胞样外观的塑料粘附。放大10 倍。(C) WJ-MSC表面抗原标记物的流式细胞术。(D) WJ-MSC多向分化为 (a) 成骨细胞（茜素红染色），(b) 成脂细胞（油红O染色）和 (c) 软骨形成细胞（阿尔新蓝）。放大10倍。

间充质干细胞刺激组织修复

众所周知，MSCs的有益结果是通过生物因子的旁分泌释放而不是将细胞植入受体组织中产生的。出于本次审查的目的，检查MSCs再生特性的研究将归纳为以下主要主题：血管发育、抗炎和抗纤维化（图3）。

血管发育

血管生成，即新血管的形成，是组织伤口愈合的重要过程，许多药物都将其作为治疗心肌缺血、缺血性中风和糖尿病性视网膜病变等疾病的目标。心脏和脑缺血的临床前研究支持MSCs通过修复和刺激血管生长改善结构和功能结果的概念。

MSCs的血管生成特性是通过释放缺氧诱导因子、血管内皮生长因子、血管生成素和促红细胞生成素来介导的。糖尿病周围血管疾病、皮肤伤口修复和骨坏死的研究支持了 MSCs 给药后修复血管损伤的能力。

免疫调节

尽管炎症是身体对有害刺激的自然反应，但过度或长时间的炎症应激可能对细胞和组织有害。例如，慢性炎症现已成为代谢综合征发病的重要因素。因此，研究人员已开始探索炎症与MSC治疗之间的相互作用。特别是，MSC调节关键的炎症细胞类型，包括T细胞、自然杀伤细胞、B细胞和树突状细胞。MSC与这些先天性和适应性免疫细胞的相互作用导致炎症标志物。用MSCs治疗的骨退化研究也强调了它们减少巨噬细胞炎症蛋白和单核细胞趋化蛋白分泌的能力。

抗纤维化

多个小组已经记录了MSC的抗纤维化作用。在一项针对Sprague-Dawley大鼠辐射诱导的肺纤维化的研究中，Dong及其同事表明，在系统性MSC滴注后，促纤维化转化生长因子-β和肿瘤坏死因子-α有所减少。作者推测MSCs还通过分泌肝细胞生长因子和前列腺素来抑制肺纤维化。

总而言之，越来越多的文献证明了MSCs可能在内分泌失调中提供的潜在益处。

增强间充质干细胞存活和功能的策略

为了对受损细胞提供再生作用，移植的 MSC 必须首先在处理组织的恶劣环境中存活下来。在这个利基市场中，MSCs必须克服各种压力源，包括缺氧、炎症、高酸度和能量储备减少。延长MSCs存活时间的策略足以提供丰富的恢复因子来源，包括：(i) 预处理细胞（缺氧、机械刺激），(ii) 对MSCs进行基因修饰（用启动子靶向小发夹RNA进行病毒转染以过度表达/沉默特定蛋白质）和（iii）使用生物材料（支架、水凝胶）递送MSC。

缺氧预处理

心肌梗死的临床前研究表明，心内注射缺氧处理的干细胞可维持周围心肌细胞的活力，保留心脏功能，并且细胞植入受损心脏的能力更高。

血管内皮生长因子（遗传）过度表达

在大鼠心肌梗死模型中，通过转染病毒载体过度表达血管内皮生长因子 (VEGF)，保护MSCs免于细胞死亡，刺激血管生长，改善心脏功能并缩小梗塞面积。使用糖尿病小鼠模型，用经病毒转导表达VEGF的MSC处理的胰岛移植物显示出较低的血糖、手术后更快恢复正常血糖并改善移植物血管形成。

间充质干细胞治疗糖尿病

MSCs的多功能特性已经引起了他们作为糖尿病疗法的临床兴趣。迄今为止，已有40多项临床试验注册使用MSCs作为糖尿病治疗剂。这些研究的范围从糖尿病相关的血管并发症到伤口愈合，甚至包括用于治疗新发诊断的MSC疗法。截至2023年5月12日，142项MSC糖尿病研究已在clinicaltrials.gov上注册。在这里，我们将总结临床调查的结果，这些调查涉及使用间充质干细胞疗法治疗新发糖尿病和慢性糖尿病。

糖尿病

2015年，来自瑞典的研究人员 (Nbib1068951) 报告了第一项旨在评估自体MSC治疗新诊断1型糖尿病患者的安全性和有效性的研究。从患者的髂嵴骨髓中采集干细胞，中位全身单次剂量为2.75×10⁶个细胞/kg。他们得出结论，MSCs的施用并未导致10名患者中的任何一名发生不良事件，并且在1年的随访中提供了有希望的C肽浓度。该I期试验未显示对照组和MSC组在血红蛋白A1c (HbA1c) 或胰岛素剂量方面存在任何功能差异。

Hu及其同事进行了一项单中心、双盲研究，以检验脐带沃顿胶质来源的MSCs对新发I型糖尿病患者的安全性、可行性和初步结果（Hu等人，2013年）。MSC治疗组经历了两次静脉输注（平均细胞计数为2.6×10⁷），间隔4周。在MSC输注后9至24个月，实验组的餐后血糖和HbA1c测量值较低。此外，MSC组的胰岛素使用和空腹C肽显着改善。研究作者得出结论，在他们的小型研究中，脐带间充质干细胞移植是可行且安全的，无法检测功能差异。

在中国对患有长期2型糖尿病的患者进行胎盘来源的MSCs的初步研究表明，移植是安全、简单且可能有效的（Jiang等人，2011年）。该调查包括10名病程≥3年、胰岛素依赖（≥0.7U/kg/天）至少1年且血糖控制不佳的2型糖尿病患者。受试者平均收到1.35×10⁶/kg胎盘干细胞在三个不同的场合，静脉输注之间间隔1个月。治疗六个月后，所有患者的胰岛素剂量和HbA1c测量均显示出改善的趋势。此外，MSC治疗后C肽和胰岛素释放也更高。此外，这项研究包括一组更接近实际临床情况的个体，因为他们还患有其他合并症，包括心脏病、肾脏疾病和血管并发症。

最近，研究人员已经开发出分泌胰岛素的MSC，并将它们与造血干细胞联合输送给I型糖尿病患者（Vanikar等人2010 年，Thakkar等人2015 年）。与同种异体移植相比，通过胰腺内途径进行的自体移植往往在15-24个月时具有改善的C肽和餐后血糖。两项研究都将干细胞管理视为具有潜在益处的安全程序；然而，需要进行更大规模的研究来证实他们的发现。

表1总结了利用间充质干细胞治疗糖尿病的临床试验列表。

作者、年份、MSC 样本量、国家	客观的	纳入标准	源码	MSC剂量和递送	结果
蔡等(2016) n=21中国1年	研究联合UC-MSC和自体骨髓单核细胞移植（无需免疫治疗）对确定的T1D患者的代谢控制和安全性的潜在益处	– 18–40岁 – 男女 – T1D病史≥2年和≤16年 – HbA1c≥7.5% &≤10.5% – 空腹血清C肽 <0.1pmol/mL – 每日胰岛素需求量<100IU	来自单月新生儿的脐带沃顿氏胶质来源的MSC+来自髂嵴的自体骨髓单个核细胞	UC-MSCs (1 × 10 6 /kg) BM-MNCs (107 × 10 6 /kg) 胰内	MSC队列中无严重不良事件 1例伴短暂性腹痛； 1例穿刺部位出血 MSC组自我报告低血糖事件较少MSC组 C肽AUC提高106%，而对照组降低8%MSC组 血清胰岛素AUC提高 49%，对照组降低6% HbA1c、FBG、胰岛素剂量水平在第 3、6、9 和12个月时下降，而在对照组中它们保持稳定
胡等(2016) n=31中国3年	探索 WJ-MSCs 输注对T2DM患者的长期安全性和有效性，随访期为36个月	– 18-60 岁患有 T2DM – 男女皆宜 – 根据ADA进行糖尿病诊断	来自单月新生儿的脐带沃顿氏果冻来源的 MSC –	两次静脉输注间隔1个月 每次输注剂量：1×10 6 /kg	没有发现严重的不良反应，包括：发热、寒战、肝毒性、超敏反应、感染、出血、蛋白尿、心肌梗塞或血栓栓塞事件,没有患者出现严重的低血糖在MSC组中观察到C肽和胰岛素剂量的改善,轻微有益于 HbA1c和空腹血糖
斯凯勒等人。(2015) n=45美国12周研究	评估成人同种异体骨髓来源的间充质前体细胞在 T2D 中的安全性、耐受性和可行性，单独使用二甲双胍或与一种额外的口服抗糖尿病药物一起控制不当	– <80岁患有 T2D – HbA1≥7.0% 至 <10.5% – 单独使用二甲双胍或与其他口服 降糖药（噻唑烷二酮除外）联合使用至少 3 个月 同意在整个研究期间使用避孕措施符合条件	骨髓来源的间充质前体细胞	0.3×106 /kg ( n  =15) 1×106 /kg ( n=15) 2×106/kg ( n=15) 静脉	MSC组和安慰剂组之间的治疗紧急不良事件具有可比性 MSC组有1名受试者出现严重腹痛 在12周的研究中没有出现严重不良事件MSC组没有停药或严重低血糖事件 实验组对MSC没有免疫反应
( Carlsson et al. 2015) n=9瑞典1年研究	评估自体间充质干细胞治疗近期诊断为1型糖尿病患者的安全性和有效性	–18-40岁患有 T1D–在入组前不到3周诊断，并且受刺激的C肽水平 >0.1nmol/L	髂嵴自体骨髓单个核细胞	中位数2.75×106 个细胞/kg静脉内	MSC组耐受无副作用的移植在任何研究中均未诊断出肿瘤或慢性感染,在MSC组中，所有研究患者均未发生高血糖酮症酸中毒C肽值的AUC（进餐耐受性测试后）保留/增加
( Dave et al. 2015) n = 10India3年研究	描述体外MSC分化的胰岛素分泌细胞与造血干细胞共输注治疗IDDM的经验	– 8-45 岁患有 IDDM – 任何性别 – 诊断至少6个月，血清C肽水平低 (<0.5 ng/mL)	自体脂肪组织 MSC 分化为胰岛素分泌细胞 + 自体骨髓来源的 HSC	自体：2.7 × 10 4 /kg 分泌胰岛素的 MSC 同种异体：脂肪 MSCs-2.1 × 10 4 /kg 分泌胰岛素的 MSC， 注入门脉循环、胸腺和皮下组织	干细胞输注没有不良影响所有患者的C肽、Hb1Ac、血糖状态和外源性胰岛素需求均得到改善 患者恢复了正常的生活方式和不受限制的饮食
( Thakkar et al. 2015 ) n=20（10个自体；10个同种异体）印度2年研究	评估自体与同种异体干细胞移植的安全性和有效性	– 8-45岁患有 T1DM–诊断时间>12个月–存在谷氨酸脱羧酶 (GAD) 抗体–低血清C肽	自体组：腹部脂肪MSCs 和骨髓HSCs 同种异体组：非糖尿病腹部脂肪 MSCs和骨髓 HSCs	自体2.7×104 /kg 分泌胰岛素的 MSC 同种异体：脂肪 MSCs-2.1×104 /kg 分泌胰岛素的 MSC，注入门脉循环、胸腺和腹部皮下组织	无不良影响、发病率或死亡率平均胰岛素需求、血清C肽、平均 HbA1c持续改善
( Hu et al. 2013) n=15中国2年研究	评估WJ-MSCs 对新发T1DM的长期影响	–根据ADA≤6个月且空腹C肽≥0.3 ng/mL的T1DM≤ 25岁的男女患者	新生儿脐带沃顿氏胶质干细胞	2.6×107个细胞 静脉内	无明显不良反应 对照组与实验组空腹血糖无差异9个月后，MSC组HbA1c、胰岛素用量、C肽均有改善
瓦尼卡等人。(2010) n =11印度1年学习	目前通过共移植分泌胰岛素的脂肪来源的 MSC 和骨髓 HSC 进行胰岛素替代疗法的研究结果	– 5-45岁患有 IDDM至少6个月 – 任何性别 – 血清C肽水平低 (<0.5ng/mL)	脂肪组织和骨髓来源的 MSC 和 HSC，分别	移植的平均总细胞量为96mLs，培养的骨髓有核细胞计数：平均值为 28×10 3/μL和 MSC-1.2×103 /μL	无与干细胞输注或诱导治疗相关的不良/不利副作用任何患者均无DKA
刘等人。(2014) n=22中国1年学习	探索WJ-MSC移植治疗T2DM患者的疗效和安全性，治疗后随访12个月	– 根据ADA标准，患有T2DM的18-70岁 –任何性别，未怀孕或哺乳 – 最近抗糖尿病治疗（包括至少3个月的药物和/或胰岛素注射）血糖控制不佳 – 谷氨酸脱羧酶抗体阴性 –空腹血糖水平≥7.0mmol/L和 HbA1c≥7% – 有机充足：心脏、肝脏、肾脏和肺	来自足月新生儿的脐带沃顿氏胶质衍生 MSC	第一次移植：静脉内 第二次移植：胰内 每次输注剂量：1×10 6 个细胞/kg	3 名患者在手术后第 1 天发热 1名患者出现皮下血肿 1名患者出现恶心、呕吐和头痛 HbA1c、胰岛素用量和空腹C肽轻度改善 全身炎症标志物在6个月时减少
( Jiang et al. 2011 ) n  = 10 中国	评估胎盘来源的 MSCs 在 T2DM 中的安全性和临床可行性	–30-85岁患有 T2DM – 糖尿病病程≥3 年 –需要胰岛素以 ≥0.7 U/kg/天的剂量达到最佳血糖控制至少 1 年	胎盘来源的间充质干细胞	平均总量1.35 × 10 6 /kg 间隔1个月的三次静脉输注	细胞移植后未观察到全身表现 6个月时，治疗后平均胰岛素用量、C 肽和 HbA1c 有所改善

哪些糖尿病患者会受益于间充质干细胞治疗？

鉴于El-Badawy和El-Badri的荟萃分析结果，I型和II型糖尿病患者可以从MSC治疗中获益 ( El-Badawy & El-Badri 2016)。此外，作者还讨论了处于糖尿病早期阶段的患者可能是干细胞治疗的最佳人选。尽管本综述纳入了22项研究，但只有6项研究（共112名患者）使用了MSC，其中只有2项研究侧重于早发性诊断（共 49名患者）。尽管如此，这四项针对慢性I/II型糖尿病患者（平均病程8年）的研究在糖尿病测量方面有所改善，这有力地证明了进一步研究以明确描述可能受益于MSC治疗的潜在糖尿病人群是合理的。

临床应用前对基于细胞的产品的监管

迄今为止，尚无用于分离、表征、扩增、效力测试或MSC病原体筛选的标准化方法。美国食品和药物管理局 (FDA) 对基于细胞的产品的监管侧重于三个主要主题：(i) 预防通过受污染的组织传播传染病，(ii) 正确处理和加工组织，以及 (iii) 证明细胞的临床安全性和有效性，尤其是经过大量操作后。FDA还要求组织加工设施注册、列出其产品并提供准确的产品标签。

脐带间充质干细胞的维护

公共和私人生物库已经牢固地建立起来，用于冷冻保存来自脐带血的造血干细胞。私人银行最近提供了一种冷冻保存脐带组织和脐带血间充质干细胞的选择。

然而，储存MSC的成本可能成为一个问题，因为收集、处理和保存的初始费用在1000到3000美元之间 此外，银行中心每年收取数百美元的存储费用。来自拉夫堡大学的研究人员对同种异体诱导的多能干细胞衍生的β细胞疗法进行了一项具有启发性的成本效益分析。假设干细胞治疗的成本约为200,000美元，计算得出在有/无免疫抑制治疗的情况下实现成本效益（与胰岛素治疗相比）所需的移植物/移植生存期在8到11年之间。然而，目前的证据表明，移植物β细胞功能维持8-11年的可能性极小。一种更具成本效益的方法可能需要脐带血来源的间充质干细胞给药。

间充质干细胞的同种异体移植

MSC同种异体管理的优势包括：(i) 广泛可用性，(ii) 低成本 (iii) 和质量控制。虽然MSCs可以减少移植物抗宿主病的临床后遗症，但一些研究质疑同种异体移植物的安全性。例如，在同种异体皮肤移植大鼠模型中输注供体MSC可诱导免疫原性反应（更高的TNF-α水平）。在Seifert的动物研究中，用同种异体MSCs 预处理实体器官移植导致更高的炎症水平和排斥迹象的趋势。

尽管在临床前环境中有这些发现，但I期临床试验尚未报告MSC同种异体移植后的排斥/严重免疫反应。更大规模和长期的人体研究将需要评估供体来源的 MSC继发排斥和/或炎症的风险。

未来目标

在临床医学广泛使用MSCs（或其衍生物）之前，许多未解决的问题仍然存在：

阐明内源性干细胞、外源性干细胞及其对微环境的反应之间的相互作用对于释放MSCs作为内分泌疾病治疗剂的潜在用途至关重要。

结论

鉴于它们具有减轻纤维化、调节炎症和促进血管生长的能力，MSC为内分泌失调患者提供了一种有前途的治疗策略。来自各种组织和器官的MSC的无限可用性及其有益特性加强了这些细胞类型在再生研究中的广泛使用。

参考资料：Moreira, A., Kahlenberg, S., & Hornsby, P. (2017). Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for diabetes, Journal of Molecular Endocrinology, 59(3), R109-R120. Retrieved May 12, 2023, from https://doi.org/10.1530/JME-17-0117

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