干细胞作为神经退行性疾病的潜在治疗方法之肌萎缩侧索硬化篇

干细胞具有巨大的治疗潜力，多年来一直是研究的主题。大多数神经系统疾病，如多发性硬化症（MS）、肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）、阿尔茨海默氏病（AD）、帕金森氏病（PD）和亨廷顿氏病（HD），都是无法治愈或非常难以治疗的。因此，人们寻求使用干细胞的新疗法。干细胞移植往往是患者康复或减缓疾病症状进展的唯一希望。

近日，波兰什切青波美拉尼亚医科大学检验医学系在《Cellular and Molecular Neurobiology》期刊，发表了一篇使用干细胞作为特定神经退行性疾病的潜在治疗方法：综述。

在对干细胞用于神经退行性疾病的文献进行分析后，得出了最重要的结论。干细胞疗法在ALS、HD、PD治疗中的有效性已得到证实。间充质干细胞可减缓渐冻人症的进展，并显示出有希望的早期疗效迹象。（鉴于内容较多，本期着重将干细胞技术在肌萎缩侧索硬化的临床进展）。

临床应用干细胞治疗神经退行性疾病的类型有哪些？

所有发育的组织和器官均源自干细胞（SC）。这种类型的细胞可以长期自我更新和分裂。然而，它们只有在收到适当的信号后才会专业化。成体干细胞 (ASC) 只能转化为一种细胞类型，例如骨骼肌细胞或表皮细胞，或产生一种细胞类型（来自单个胚层）。此外，它们可以分化成源自所有三个胚层（外胚层、内胚层和中胚层）的多种细胞，这三个胚层是胚胎在发育过程中形成的区域。根据分化潜能，干细胞可分为全能细胞、多能细胞、专能细胞和单能细胞。

多能干细胞：多能干细胞 (PSC) 无限繁殖并分化为所有三个胚层的细胞。这两个特性使PSC成为治疗各种疾病和损伤的细胞疗法的有吸引力的来源。与临床应用特别相关的是胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPSC）。第一个人类ESC系是从捐赠的人类胚胎中建立的，而由于捐赠胚胎的供应有限，人类ESC的衍生在伦理和政治上仍然存在争议。虽然这些细胞引起了伦理和免疫学方面的担忧，但人类ESC研究向临床实践的转化已经开始。通过病毒介导的不同组重编程因子（OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC或OCT4、SOX2、NANOG）过表达，从体细胞生成人诱导多能干细胞 (iPSC) 样胚胎干细胞 (iPSC) 、和LIN28）于2007年在该领域开辟了更多机会。诱导多能干细胞绕过了围绕人类ESC的主要争议，为个性化医疗提供了相同的益处和新视角（见图1）。

使用干细胞治疗五种神经退行性疾病（渐冻症、多发性硬化症、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病），即使在治疗几个月后也显示出有希望的结果。通过神经保护作用，干细胞可以延缓疾病的进展和免疫调节作用。然而，根据疾病类型的不同，使用相同类型的细胞具有不同的治疗效果，例如，在ALS治疗中使用间充质干细胞（MSC）可以改善呼吸和运动技能，而在AD治疗中则可以改善记忆力和运动能力。

诱导多能干细胞：诱导多能干细胞 (iPSC) 具有与ESC相同的特性。因此，基于hiPSC的疗法可以有效替代人类ESC，且不会破坏胚胎。与获取人类ESC的侵入性方法相比，人类iPSC能够通过特定因素和微创程序对患者特异性细胞进行重编程。

人类多能干细胞是细胞研究、细胞替代疗法和疾病建模的良好来源。数百个人类ESC和iPSC系已被培育出来，用于治疗各种神经退行性疾病。

神经干细胞：在神经退行性疾病中具有巨大应用潜力的干细胞无疑是神经干细胞。除间充质干细胞外，它们在临床试验中应用最广泛。NSC是指具有分化为神经元和中枢神经系统胶质细胞潜力的细胞。

NSC由两个基本特征定义：自我更新和多能性。在发育过程中，神经干细胞（NSC）形成中枢神经系统。最初，NSC（也称为神经上皮细胞）分化为放射状胶质细胞并增殖为神经祖细胞（NPC）池。这些神经干细胞和祖细胞 (NSPC) 代表这两个群体，并被确定为成人中枢神经系统中唯一的自我更新细胞类型。NSPC通过神经发生迁移并分化为高度定义的神经元网络，少突胶质细胞和星形胶质细胞通过胶质细胞生成产生。因此，NSPCs是再生医学研究的主线。神经营养/生长因子、转录因子和经典途径等外在和内在因素在发育和成年期间指导神经发生和胶质细胞生成。神经干细胞（NSC）移植为开发潜在的强大的新的治疗策略提供了基础，该策略适用于广泛的临床病症，包括中风和精神疾病，如自闭症和帕金森病。

成体干细胞：也称为成体干细胞，具有很高的增殖潜力，可以根据其来源组织分化成不同的细胞类型。成体干细胞会产生新组织以应对损伤、疾病或定期维护。成体干细胞具有自我更新、克隆形成和多能性；它们的主要作用是维持组织稳态。广泛的临床前和临床研究已证明这些成体干细胞的结构和功能再生潜力，例如骨髓来源的单核细胞、造血干细胞、间充质基质/干细胞、成体干细胞）。因此，基于成体干细胞的疗法在治疗各种退行性疾病和使衰老组织恢复活力方面引起了广泛关注。然而，它们的增殖性质也使它们变得危险。保持干细胞静止而不增加的机制失调可能导致癌症。

间充质干细胞：骨髓和其他成体组织中存在着一群多能基质细胞，它们可以分化成不同的骨骼组织，如骨、软骨和脂肪（间充质干细胞——MSC）。MSC可以从多种来源获得，即骨骨髓（BM-MSC）、脂肪组织（AT-MSC）、胚胎组织（E-MSC）、脐带血（CB-MSC）、成熟细胞重编程（iMSC）和围产期组织沃顿氏胶（WJ-MSC）和羊膜。它们具有显着的治疗潜力，特别是在骨科应用中。它们还可能在再生医学和癌症治疗中发挥更广泛的作用，如抗炎药、免疫抑制剂和基因/蛋白质治疗的载体。更重要的是，它们不会引起畸胎瘤。它们易于分离并具有区分多能性的能力。

单能干细胞：最窄的分化可能性和多次分裂的独特特性是单能干细胞的特征。后一个特征使它们成为再生医学治疗用途的有前途的候选者。这些细胞只能形成一种类型的成熟细胞（例如上皮细胞），与成体细胞相比保留了分裂的能力。在中枢神经系统 (CNS) 中，当神经组织损伤是急性或慢性时，它们会出现在嗅觉上皮和室管膜中。因此，干细胞不仅对年轻人有效且富有生产力。在动物模型中，已经开始开发使用人类干细胞的新疗法。在治疗神经退行性疾病如肌萎缩侧索硬化症、帕金森病）。

本综述旨在表明，借助干细胞疗法，不仅可以延缓帕金森病、阿尔茨海默病 (AD)、渐冻症和亨廷顿舞蹈病等无法治愈的神经退行性疾病的进展，而且最重要的是，可以消除神经退行性疾病的根源问题。尽管迄今为止的结果存在争议，但它们也表明纯干细胞疗法是一种重要且越来越实惠的治疗选择（见图2）。

干细胞可以根据其分化能力进行划分。两个主要群体是多能细胞和成体生物体中发现的细胞。正常情况下，成体生物体中不存在多能干细胞，它们是通过分离囊胚（胚胎干细胞）的内细胞团而获得的。它们能够分化成所有三种细胞谱系的细胞。成体干细胞是多能的或单能的。多能干细胞能够分化成一种谱系的多种细胞类型，而单能干细胞则分化成一种特定的细胞类型。多能和单能干细胞群可以存在于同一器官中，例如皮肤。

神经退行性疾病

神经退行性变或神经细胞丧失是许多神经系统疾病的原因。它们可以是先天性的，也可以是后天性的，例如帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症或脊髓性肌萎缩症。在所有这些疾病中，观察到不同的神经细胞损失。

在大多数神经退行性疾病中，这个过程很缓慢，需要数月甚至数年的时间。大脑老化是细胞退化的主要原因。尽管如此，许多因素都会加速这一过程，例如线粒体功能障碍、氧化应激、细胞凋亡激活（程序性细胞死亡）或神经炎症。蛋白质聚集体的形成、局部神经元死亡和持续进展的症状是神经变性的典型特征。然而，关于这些疾病的发病机制和病因学的知识仍在遗传学的各个领域进行研究。然而，早期诊断和治疗是对抗这种疾病最有效的方法。人们对再生医学越来越感兴趣（见图3）。

神经退行性变是神经细胞受损，导致整个神经系统功能障碍的过程。受损的神经元工作能力较差，无法以正常效率与其他神经元沟通，并最终死亡。它可能是由基因功能障碍引起的，该功能障碍破坏了正常蛋白质的产生，导致蛋白质结构紊乱，无法发挥其功能，例如IT 15基因编码的亨廷顿蛋白聚集在神经元的细胞核中，从而抑制了作用各种蛋白质，包括关键转录因子

干细胞与肌萎缩侧索硬化症

肌萎缩侧索硬化症（ALS）渐冻症是一种神经退行性疾病，选择性地影响大脑和脊髓的运动神经元。随着时间的推移，中枢（大脑）和外周（脊髓）运动神经元消失，逐渐失神经导致肌肉丧失。

这些神经元的轴突被认为是我们体内最长的，可以从大脑皮层开始，延伸到脊髓的骶段。在美国，每年有6000名新患者被诊断患有ALS。ALS的患病率为每100,000人中有5.0人，大约有16,000至20,000人确诊患有明确的ALS，预后为2-5年。ALS患病率最高的是白人、男性和 60岁或以上的人群。

全球范围内，ALS发病的平均年龄为62岁 。ALS有两种主要分类：散发性（特发性）和家族性。家族性ALS发生在大约5%至10%的ALS患者中，通常是由于显性特征所致。散发性ALS包括所有其他ALS患者。散发性ALS受影响人群约占67%男性。在家族性ALS中，男女比例几乎为1:1。

诊断主要通过临床检查结合神经传导研究（NCS）、肌电图（EMG）和实验室检查（血细胞计数、电解质、肝功能和甲状腺功能检查、肌酸激酶、红细胞沉降率、抗核抗体、类风湿因子）来确定、维生素B12、抗GM1神经节苷脂抗体、免疫固定血清蛋白电泳和免疫固定24小时尿蛋白电泳。

ALS的主要初始症状是远端下肢和手臂进行性单侧无力，没有缓解或复发。非典型症状包括情绪不稳定、额叶型认知功能障碍、体重减轻、癫痫发作和不伴肌无力的痉挛。患者还可能出现其他症状，例如肌肉痉挛或癫痫发作、吞咽或咀嚼困难以及扣扣子等简单任务。不幸的是，ALS患者意识到自己的功能逐渐下降。他们往往保留较高的心理功能，例如解决问题、推理、理解和记忆。

目前ALS没有有效的治疗方法，并且提议的基因或干细胞疗法仍然具有挑战性。表1列出了当前ALS患者细胞疗法的概述。

肌萎缩侧索硬化症（ALS）
年	动物模型	细胞类型	治疗效果	文学
2009年	人类	人脊髓源性NSC	1. 所有患者都能耐受治疗，没有出现任何与手术或干细胞植入相关的长期并发症 2. 一名患者的临床状况出现改善 3. 在该弱势群体中，脊髓对将细胞有效负载递送至颈椎或胸腰椎具有良好的耐受性	彼得鲁等人。( 2021 )
2011年	人类	子宫内自然死亡的胎儿人类神经干细胞 (hNSC)	1. 术后18个月内未观察到治疗导致疾病进展加剧 2. 相反，两名患者在ALS-FRS-R量表上的运动分项显示出暂时的改善	马志尼等人 ( 2019 )
2016年	人类	骨髓间充质干细胞 (BM-MSC)	1. 暂无结果	[NCT02881489]
2019年	人类	诱导骨髓间充质干细胞分泌神经营养因子(MSC-NTF)	1. 病情进展快的患者，疾病进展率在早期时间点有所改善， 2. 2周后，脑脊液神经营养因子增加，脑脊液炎症生物标志物减少， 3. 单剂量MSC-NTF细胞移植是安全的，并显示出早期有希望的疗效迹象 4. 在III期试验中，MSC-NTF观察到神经炎症、神经退行性变和神经营养因子支持的脑脊生物标志物显着改善，而安慰剂没有变化	贝里等人。( 2019 )
2020年	人类	沃顿氏胶间充质干细胞 (WJ-MSC)	1. 患者的中位生存时间增加了一倍， 2. 通过ALSFRS-R测量，观察到三种类型的疾病进展：进展率降低、无变化和进展率增加。然而，风险收益比是有利的 3.未观察到药物的严重不良反应	巴尔切夫斯卡等人。（2020）
2020年	人类	自体骨髓间充质干细胞（BM-D MSCs）	1. 病程自然快速的患者，治疗后观察到病情减缓，但事实证明该组太小，无法评估这些变化是否具有统计学意义	斯维克等人。（2020）
2021年	人类	间充质干细胞（MSC）	1. 患者在直至最后一次移植的整个期间内 ALSFRS-R 进展率有所改善 2. 反复鞘内注射自体MSC对于ALS患者是安全的，并为与细胞注射间隔相关的中期临床益处提供了线索	[NCT04821479]

神经元萎缩的病因尚不清楚，也没有减缓疾病进展的病因或治疗方法。ALS的治疗仅是对症治疗。病程取决于人的个性和生活环境。不幸的是，这种情况通常会在2-4年内进展至死亡。唯一能缓解病程的药物是利鲁唑和依达拉奉。利鲁唑降低谷氨酸毒性，但仅延长寿命约3个月，依达拉奉最近已获得批准，但尚未显示生存数据。细胞疗法的重点是延缓疾病进展和抑制炎症。目前的研究旨在选择合适的细胞治疗剂量。

诱导多能干细胞在肌萎缩侧索硬化症中的应用

神经退行性疾病，如ALS，具有高度的病因异质性，具有多种遗传原因、环境因素以及在衰老神经系统的多细胞环境中发挥的复杂病理生理学作用。这种复杂性给体外建模带来了重大挑战。

然而，2006年人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 技术的出现极大地改变了我们为此类疾病创建生理相关体外模型的能力。由于细胞供体的遗传背景在细胞重编程过程中得以维持，hiPSC提供了一种极好的方法来评估致病突变对神经退行性疾病中相关细胞类型（如神经元和神经胶质细胞）的影响，否则这些细胞类型是不可接近的。除了单一栽培分化方案外。在ALS研究中使用hiPSC有多种选择：

• 1、hiPSC脊髓运动神经元 (MN) 的直接分化，这是其在神经发育、神经变性研究和未来临床潜在应用研究中应用的重要第一步。

• 2、hiPSC分化为星形胶质细胞和小胶质细胞。在ALS等神经退行性疾病中，星形胶质细胞和小胶质细胞被认为通过促进大脑炎症（神经炎）在发病机制中发挥作用。在大脑和脊髓中，星形胶质细胞和小胶质细胞在神经元中发挥其主要功能并相互发出信号。尽管这些相互作用的变化与ALS相关，但目前尚不清楚是什么触发了神经炎症以及这些变化如何导致ALS的神经退行性变。然而，通过调节MN-胶质细胞通讯来控制神经炎症作为ALS的潜在治疗策略正在积极研究中。

• 3、hiPSCs分化为星形胶质细胞，包括四个步骤（1）hiPSCs分化为神经祖细胞（NPCs）；(2) 神经模式将星形胶质细胞指定到中枢神经系统的特定区域；(3)长期培养或诱导胶质生成开关；(4)星形胶质细胞终末分化和成熟。

• 4、hPSC分化为小胶质细胞，包括四个步骤 (1) 初始图案化为与原条相对应的细胞；(2)分化为成血管细胞和原始造血干细胞；(3)分化为骨髓祖细胞；(4)终末小胶质细胞的分化和成熟。

然而，利用hiPSC进行建模面临着许多挑战，例如技术重现性差以及缺乏对细胞间串扰的建模。可能的解决方案包括细胞纯化策略和开发更复杂的多细胞和三维培养系统。

iPCS越来越多地用于ALS研究。尽管迄今为止发表的研究主要集中在基于iPSC的ALS细胞模型，用于疾病机制或药物筛选。使用ALS小鼠模型对iPSC衍生的NSC移植进行的几项研究显示了治疗的积极效果，包括延长寿命。

最近，据报道，帕金森病患者成功移植了iPSC衍生的多巴胺能神经元，患者的症状和生活质量显着改善 ，不仅为帕金森病而且为ALS等其他神经退行性疾病开辟了一条新的治疗方法。

肌萎缩侧索硬化症中的间充质干细胞和神经干细胞

ALS基础干细胞研究的总体目标是通过防止衰弱神经元进一步退化并通过神经营养因子的产生和释放调节周围生态位来替换受损神经元并逆转其功能。

关于使用间充质干细胞治疗ALS的动物研究已取得了有希望的结果。例如，静脉内 (IV) 和鞘内 (IT) 施用MSC已被证明可以抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE)并促进脊髓损伤或诱导脱髓鞘后的髓鞘再生。 

在ALS小鼠模型中，静脉内 (IV)、鞘内 (IT) 或鞘内施用MSC可改善动物的运动性能并延长动物的存活时间。

诱导间充质干细胞分泌高水平神经营养因子（MSC-NTF）的临床试验取得了良好的结果，这是一种能够靶向多种途径的新型自体细胞疗法，可以安全地减缓ALS疾病的进展。

48名患者接受了自体骨髓来源的MSC诱导分泌神经营养因子 (NTF)。它们通过同时鞘内和肌内注射的方式递送给肌萎缩侧索硬化症（ALS）参与者。在快速进展的受试者亚组中，疾病进展率在早期时间点有所改善。细胞给药后2周，脑脊液神经营养因子增加，脑脊液炎症生物标志物减少。结果表明，单剂量MSC-NTF细胞移植是安全的，并显示出早期有希望的疗效迹象。

在III期试验中，参与者接受了三种鞘内MSC-NTF或安慰剂治疗。33%的MSC-NTF和28%的安慰剂参与者在28周时达到了临床反应标准。对参与者在28周时的反应率进行预先指定的分析，MSC-NTF为35%，安慰剂为16%。使用MSC-NTF观察到神经炎症、神经变性和神经营养因子支持的脑脊生物标志物显着改善，而安慰剂则没有变化。患者对治疗的耐受性良好，但未达到统计学意义。然而，它提供了有关研究设计和治疗反应的潜在生物标志物的重要信息，以供未来临床试验使用。与安慰剂组相比，患有这种疾病的卧床患者能够保持更好的功能。

2019年，马志尼等人进行了一项研究来评估施用人类神经干细胞（hNSC）系列的可行性和安全性。18名ALS患者接受了hNSC显微注射，注射到腰椎或颈脊髓的灰质通路中。在移植前后对患者进行临床、心理、神经放射学和神经生理学评估监测。ALS功能评估量表的进展出现短暂下降（细胞给药后1-4个月），并且没有副作用或疾病进展。这种移植是高度标准化的细胞治疗产品的第一个例子。它可以在体外重构并稳定扩增。鉴于这一点和潜在的治疗效果，需要使用hNSC进行进一步的研究。

2016年，科学家开始研究自体骨髓间充质干细胞 (BM-MSC) 对诊断为肌萎缩侧索硬化症患者的安全性和耐受性[NCT02881489]。患者被分为两组：第一组——接受一次鞘内注射，第二组——接受三次BM-MSC注射。随后，BM-MSC将被应用到脑脊液中。除其他外，将通过治疗的安全性和不良事件的存在来评估治疗的有效性，并且将监测功能评定量表（FRS）以确定ALS进展率。然而，由于调查仍在进行中，这项研究的结果尚未揭晓。

另一方面，神经干细胞疗法通过在NSC的支持作用下保留剩余细胞来替换丢失的细胞。植入的人类NSC已被证明可以通过多种作用（包括产生神经营养因子和减少神经炎症）延缓ALS小鼠模型的疾病发作和进展并提高总体生存率。胶质细胞和NSC可以分泌影响神经保护的神经营养因子和抗炎因子。脊柱移植似乎对NSC最有效。

NSC的临床前和临床试验中已经进行了不同级别的鞘内给药，包括颈椎和腰椎级别。这些研究结果令人鼓舞，表明移植后，人类NSC成功整合到宿主组织实质中，分化为胶质细胞和神经元，并通过释放生长因子（IGF-1、GDNF等）诱导有益作用和免疫调节。然而，仍然存在一些障碍，包括NSC在组织中的存活时间和免疫介导的同种异体移植排斥。

2009年，FDA批准了第一个将人脊髓源性神经干细胞移植到ALS患者体内的1期临床试验，随后进行了2期临床试验。这些研究证明了它们的安全性，但未能通过治疗减缓疾病的进展。

2011年，Mazzini等人。在意大利批准了一项人类胎儿神经干细胞的1期临床试验，证明了其安全性和可行性。在这项临床试验的前4个月里，几位患者通过人类胎儿NSC移植经历了短暂的改善。

根据之前的临床前和临床研究，未来需要开展更多工作才能从干细胞治疗ALS中获得最大益处。此外，建立细胞制备和移植的标准化方案将有助于为未来的临床前和临床研究生成准确且可重复的数据。需要将临床试验与适当的修改、大量患者和长期随访相结合，才能获得有关干细胞疗法在ALS中的疗效、安全性和可行性的重要见解。

参考资料：Cecerska-Heryć, E., Pękała, M., Serwin, N. et al. The Use of Stem Cells as a Potential Treatment Method for Selected Neurodegenerative Diseases: Review. Cell Mol Neurobiol 43, 2643–2673 (2023). https://doi.org/10.1007/s10571-023-01344-6

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