鼻内施用干细胞外泌体治疗中枢神经系统疾病

概述：外泌体是脂质双层封闭的小细胞囊泡，由各种细胞主动分泌，在细胞间通讯中发挥着至关重要的作用。在这篇综合综述中，我们旨在概述鼻内给予外泌体治疗中枢神经系统疾病的基础和临床研究。此外，我们阐明了潜在的治疗机制，并对这种方法的前景提供了见解。

介绍

中枢神经系统（CNS）疾病带来了重大挑战。干细胞疗法对于改善脑损伤和恢复神经连接具有巨大的希望。因此，目前正在进行大量的基础和临床研究。

近年来，大量的研究工作致力于阐明外泌体作为干细胞重要治疗机制的作用。外泌体/细胞外囊泡是 40-200nm的纳米大小囊泡，由双层脂质层膜组成，含有大量分子，包括DNA、mRNA、微小 RNA (miRNA) 和蛋白质。干细胞来源的外泌体凭借其抗凋亡、抗炎、神经源性和血管生成特性，在缓解中枢神经系统疾病方面表现出巨大的潜力。重要的是，外泌体比干细胞本身具有明显的优势，包括能够进行冷冻保存而不降解、降低免疫原性和增强血脑屏障渗透性。

为了最大限度地提高治疗效果，选择最佳移植途径在细胞相关治疗领域至关重要。在通常考虑的外泌体移植治疗中枢神经系统损伤的途径中，即静脉内、动脉内和脑内途径，每种方法都有其局限性。例如，静脉移植会导致全身稀释，从而导致大脑中外泌体的积累减少。

• 动脉内移植需要插入导管，这具有缺血性中风的潜在风险。另一方面，脑内移植可能由于使用移植针而引起额外的脑损伤。鉴于这些困难，鼻内移植作为中枢神经系统疾病中外泌体递送的可行替代途径而获得认可。外泌体的小尺寸使其能够被嗅觉和三叉神经有效吸收，促进其轴突转移到脑细胞，同时绕过血脑屏障。

在这篇综述中，我们总结了鼻内给药干细胞外泌体治疗中枢神经系统疾病的方法，重点关注基础和临床研究，以阐明其功效、作用机制以及局限性。这些信息旨在为研究人员提供开发未来应用程序的见解。

搜索策略和选择标准

在PubMed ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed )上进行文献检索，以查找2023年5月有关鼻内外泌体给药治疗CNS疾病的基础研究文章。检索中选择了所有年份。搜索使用关键词“鼻内”、“外泌体或细胞外囊泡”和“大脑”。纳入检索的文章要求用英文撰写，与中枢神经系统疾病相关，并且特别关注干细胞衍生的外泌体，而其他文章则被排除在外。

最终，我们选择了41篇符合本叙述性评论目标的文章。收集的数据涵盖各种疾病模型、外泌体来源、动物模型、外泌体剂量、治疗持续时间、标记方法和外泌体工程（图1）。

外泌体的来源进一步分为人类和小鼠/大鼠来源。列出了外泌体的修饰方法。描述了两个主要的治疗机制：减少神经炎症和增强细胞恢复。值得注意的是，鼻内外泌体给药的功效已在多种目标疾病中得到证实。

干细胞外泌体鼻内给药治疗中枢神经系统疾病的概述

动物模型和外泌体剂量

在各种疾病模型中研究了鼻内外泌体给药的效果（表1-7）。用于这些实验的动物模型仅为小鼠和大鼠，将这些发现外推到较大动物的可行性对于临床检查来说是必要的。通过鼻内途径施用的外泌体的总剂量在各个研究中有所不同，范围从0.02至600×10¹⁰颗粒，或5至400µg。给予小鼠的外泌体的量在动物之间有所不同，给予小鼠的外泌体的蛋白质重量往往小于给予大鼠的外泌体的蛋白质重量。然而，各组之间的颗粒数量大多相似（图2）。

大多数文章以蛋白质重量 (μg) 或外泌体颗粒的数量来描述外泌体的量，这使得比较具有不同值表示的研究具有挑战性。三项研究提供了外泌体的颗粒数量和体积。然而，每1×10¹⁰颗粒的外泌体蛋白质重量在5-200μg之间，这可能归因于测量方法不同。外泌体剂量的标准化对于促进临床应用的适当采用是必要的。

外泌体的来源

31个外泌体中有24个（77.4%）来自人类，其余7个（22.6%）利用来自啮齿动物的外泌体。间充质干细胞 (MSC)，包括源自骨髓、脂肪组织和出生相关来源的细胞，通常用作外泌体提取的细胞来源（图3）。与其他细胞来源相比，间充质干细胞具有多种优势，包括较低的细胞培养成本和较高的增殖能力。

外泌体追踪

34篇文章中有24篇 (70.6%) 使用外泌体标记进行体内跟踪。所有研究都表明，标记的外泌体不仅存在于嗅神经中，而且存在于整个大脑中，包括脑干和受伤的脊髓。

鼻内施用的外泌体的积累模式一致表明，这些颗粒由于其粘膜粘附特性​​而最初在鼻腔中积累。随后，它们逐渐通过鼻粘膜吸收，可能通过嗅觉和三叉神经的分支进入血管周围空间。最终，外泌体迁移到颅内并到达损伤部位。外泌体给药24小时后进行的荧光成像清楚地表明这些纳米载体在前脑中逐渐积累，这种现象在此后可持续长达一到两天。

将货物装载到外泌体中

外泌体通过转移封装的成分来对抗靶细胞。利用这一特性，一些研究利用了负载特定成分的外泌体，例如脑源性神经营养因子（BDNF）、miR-100、MALAT1、磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）和姜黄素。通过原始干细胞的基因工程，这些货物可以很容易地装载到外泌体上，从而通过人工装载的成分增强功效。还探索了外泌体表面的修饰以更好地传递大脑。

中枢神经系统疾病模型的鼻内外泌体给药

缺血性中风

缺血性中风通常由脑血管闭塞引起，导致其下游分支缺乏葡萄糖和氧气，从而成为全球残疾的主要原因。目前，血栓切除术和重组组织纤溶酶原激活剂治疗已标准化实施。然而，在有限的时间窗口内成功应用这些治疗方法仍然具有挑战性，据报道，只有5-10%的中风患者有资格接受此类干预，并且即使在成功再通后，大约50%的患者仍会出现神经功能缺损。

干细胞疗法在动物模型中的所有三个阶段（急性、亚急性和慢性）均显示出疗效。然而，由于临床试验结果不足，强烈需要在受损区域有效物质大量积累的其他治疗方式。在这种情况下，干细胞来源的外泌体给药被认为是一种很好的候选方法，并且探索鼻内给药外泌体刚刚引起了人们的关注（表1)。

罗登等人。(2021) 报道了一项研究，调查鼻内移植人脂肪MSC衍生的外泌体的影响。他们证明接受外泌体的组的神经功能有显着改善，并观察到增强的血脑屏障功能是治疗机制。

周等人。(2023) 证明，负载BDNF的外泌体表现出增强的神经发生、血管生成、突触可塑性和纤维保存，同时还减少炎症细胞因子。他们观察到缺血脑中BDNF/原肌球蛋白受体激酶B信号通路的上调，这是外泌体 BDNF 成功转移至受体细胞的结果。

外伤性脑损伤和脊髓损伤

创伤性脑损伤和脊髓损伤通常是由大脑或脊髓突然机械损伤引起的。虽然急性临床护理的进步提高了生存率，但许多患者仍然经历长期残疾，返回工作率不变就证明了这一点。尽管如此，Kawabori等人最近的一项研究。(2021) 报告了骨髓来源的MSC脑内移植对慢性创伤性脑损伤患者的成功效果，强调了潜在的治疗选择、现场细胞处理程序和高侵入性手术操作阻碍了全球应用。

在这种情况下，鼻内施用MSC衍生的外泌体作为一种最佳治疗选择已得到深入研究。莱昂-莫雷诺等人。（2020）和图罗夫斯基等人。(2022) 证明，鼻内施用从出生相关MSC获得的外泌体成功阻止了神经元凋亡，并实现了更好的神经功能恢复（表2）。

郭等人。(2019) 证明了鼻内施用负载磷酸酶和张力蛋白同源小干扰RNA (ExoPTEN) 的MSC-Exo对于改善完全脊髓损伤引起的神经功能缺损具有有益作用。研究人员观察到，金标记的ExoPTEN可以在脊髓损伤部位附近检测到，促进轴突生长和新血管形成，同时减少小胶质细胞增生。此外，通过体内MRI成像和电生理学研究证实了脊髓连接性。

围产期脑损伤

围产期缺氧缺血性脑损伤和早产是婴儿发病和死亡的主要原因，每1000个活产儿中就有3个发生这种情况。除了脑瘫外，缺氧缺血性脑损伤还可导致长期神经发育后遗症，包括行为、认知和心理问题以及记忆缺陷。缺氧会导致大脑中常驻免疫细胞的激活，从而产生自由基。针对小胶质细胞介导的炎症被认为是缺氧缺血性脑损伤和早产相关脑损伤的潜在治疗选择。

他们鼻内给予外泌体的主要焦点是减轻神经炎症和外泌体的抗凋亡功能（表3)。托米等人报道，用LPS和缺氧诱导的大鼠幼崽通过鼻内施用源自人脐带间充质干细胞 (MSC) 的外泌体获得了成功的治疗。作者观察到，鼻内给药的外泌体在给药后30分钟内到达大脑额叶区域，并在3小时后分布在整个大脑中。此外，施用的外泌体有效减少神经元特异性细胞死亡，促进正常髓鞘形成，并增加成熟少突胶质细胞和神经元细胞的数量。

认知障碍

阿尔茨海默氏病

阿尔茨海默病（AD）是人类最常见的神经退行性疾病，也是痴呆症的主要原因，造成了日益严重的全球健康问题。

AD的病因和发病机制极其复杂，淀粉样蛋白斑沉积和神经纤维缠结是关键的病理过程。尽管人们做出了大量努力来开发针对β或tau淀粉样蛋白的小分子药物和抗体，但这些治疗方法始终未能改善患者的认知功能。其中一种方法涉及研究海马神经再生，并使用源自AD干细胞的外泌体通过小胶质细胞激活来控制炎症（表4）。

科恩等人。(2021) 证明，通过鼻内施用人骨髓来源的间充质干细胞，可以减少海马中的胶质细胞活化和β淀粉样蛋白的积累。

高脂肪饮食和慢性高血压依赖性记忆障碍

营养过剩和高血压会破坏大脑中的正常细胞信号传导，可能影响突触功能和成人神经发生，进而导致认知障碍。流行病学证据表明，代谢紊乱，包括胰岛素抵抗和2型糖尿病，会加速大脑衰老并增加神经退行性疾病的风险。在这种背景下，鼻内施用外泌体已成为记忆障碍的潜在治疗策略。Fusco小组进行的一项研究表明，源自神经干细胞的外泌体具有减轻高脂肪饮食引起的认知障碍的能力。

帕金森病

帕金森病 (PD) 是第二常见的神经退行性疾病，影响超过1%的65岁以上人口，以及近5%的80岁以上人口。PD的主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元中α-突触核蛋白（α-syn）的异常积累。然而，迄今为止，尚未开发出有效的治疗方法来阻止疾病的进展。PD的病理生理机制之一是小胶质细胞的异常激活，导致促炎因子的释放。因此，针对这一过程已成为基于外泌体的干预措施的治疗策略。通过施用源自人牙齿间充质干细胞的外泌体，成功改善PD动物模型的运动症状和认知功能（表5）。

此外，外泌体中存在的内源性miR-133b促进神经元轴突生长和功能恢复，从而显着减轻神经炎症。总之，这些研究表明鼻内外泌体干预治疗帕金森病具有广阔的治疗潜力，这些发现有助于我们了解该疾病的病理生理学，并为开发有效的治疗方法提供宝贵的见解。

其他神经系统疾病

自闭症

自闭症，也称为自闭症谱系障碍，是一种以社交互动缺陷、认知僵化和沟通障碍为特征的神经发育障碍，通常在3岁之前出现。尽管自闭症患病率不断上升，但有效的预防和治疗选择仍然有限。自闭症的病因非常复杂，涉及遗传因素和表观遗传因素。由于病理机制尚不清楚且疾病性质多样，目前批准的药物治疗主要针对自闭症中常见的共病行为，如焦虑、多动和冲动相关行为。已研究鼻内给予外泌体以改变自闭症动物模型中的神经炎症并促进神经回路再生（表6）。

佩雷茨等人证明接受外泌体的动物表现出改善的雄性之间的社交互动并减少了重复行为。此外，他们观察到男性对女性超声波发声的增加以及母亲行为的显着改善。作者还报告称，接受外泌体治疗的动物中 GABA 受体和催产素的表达水平更高。

癫痫持续状态

癫痫持续状态 (SE) 是一种医疗紧急情况，通常通过抗癫痫药物治疗来终止，会导致慢性海马功能障碍。这种功能障碍的特点是持续炎症，小胶质细胞和单核细胞浸润激活，抑制性中间神经元丧失，神经发生异常和减弱，以及海马依赖性认知和记忆障碍。鼻内外泌体给药已被广泛研究作为改善SE后神经功能缺损的潜在干预措施。龙等人证明，鼻内施用人骨髓来源的MSC分泌的外泌体在施用后6小时内到达海马。这种给药减少了谷氨酸能和GABA能神经元的损失，减少了海马体的炎症，并导致长期认知和记忆功能的改善。

研究人员发现，鼻内给予外泌体可增强SE后海马的神经发生。总而言之，这些发现表明鼻内给予外泌体有可能恢复海马的神经回路并改善SE后的认知功能。

临床试验中鼻内外泌体给药

我们使用“Clinicaltrial.gov”对鼻内给予外泌体的临床研究进行了调查，并确定了三项相关研究（表7）。

难治性局灶性癫痫

由Guidon Pharmaceutics Ltd赞助的一项关于诱导多能干细胞衍生的外泌体（GD-iEXo-002）作为滴鼻剂治疗难治性局灶性癫痫的探索性I期临床研究正在中国北京协和医院进行。研究包括四个治疗组：低剂量组（2μg）、中剂量组（6μg和18μg）和未知剂量200μL的高剂量组。外泌体通过鼻滴管给药，持续12周。主要结局指标是安全性监测，次要结局指标包括癫痫发作频率、头皮脑电图监测和MRI神经影像。该研究于 2023年6月开始，计划于2025年11月完成。迄今为止尚未发布任何结果。

阿尔茨海默病

中国上海交通大学附属瑞金医院正在对AD受试者中同种异体脂肪间充质干细胞 (MSC-Exos) 衍生的外泌体的安全性和有效性进行评估。该研究由Cellular Biomedicine Group Ltd.赞助，是一项开放标签、单中心I/II 期试验。三种不同剂量的外泌体（低：5μg，中：10μg，高：20μg）通过滴鼻剂每周两次，持续12周（总体积：1 mL）。

安全监测是主要结局指标，认知功能测试、MRI神经影像和正电子发射断层扫描计划作为次要终点来评估疗效。该研究于2020年7月开始，计划于2022年8月完成。但尚未公布结果。

极低出生体重婴儿

计划进行一项盲法随机对照试验，研究MSC衍生的外泌体在胎龄25/0-27/6周的极低出生体重婴儿中的鼻内给药。该研究将在俄罗斯联邦莫斯科进行。

在外泌体治疗组中，婴儿将接受从每日1.2亿个MSC的条件培养基中获得的外泌体，对照组则不接受外泌体。外泌体将悬浮在500µL磷酸盐缓冲液中，并以50µL的体积注入每个鼻孔。治疗过程包括5次滴注，每次给药间隔1天。该研究的主要结果指标包括评估严重脑室内出血或囊性脑室周围白质软化症的死亡和生存率。围产期脑损伤的生物标志物，如S-100、NSE、EPO和mRNA，也将进行测试。该研究预计于2022年10月开始，计划招募10名婴儿。不过，目前招募工作尚未启动。

未来展望

鉴于干细胞来源的外泌体的非侵入性和高脑浸润能力，鼻内给药有望改善神经系统疾病。然而，在其全面临床应用之前，还需要解决一些尚未解决的问题。

• 首先，需要建立有效的分离技术，以从培养基中获得足够量的外泌体。目前，超速离心是最常见的方法，但它一次只能收集少量的外泌体。
• 其次，由于外泌体的定义尚不清楚，必须建立临床级外泌体的质量控制标准。
• 第三，外泌体对于人类患者的最佳剂量仍然未知。开发有效的跟踪方法来监测外泌体的生物分布至关重要。
• 最后，外泌体对患者的潜在副作用尚未完全了解。

因此，需要广泛的基础研究以及长期、大规模的临床试验，以促进外泌体疗法转化为临床实践。

参考资料：Gotoh, Shuho; Kawabori, Masahito*; Fujimura, Miki. Intranasal administration of stem cell-derived exosomes for central nervous system diseases. Neural Regeneration Research 19(6):p 1249-1255, June 2024. | DOI: 10.4103/1673-5374.385875

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