胚胎干细胞进行多次治疗，可保持经历自然衰老小鼠的生育能力和卵巢功能

卵巢有两个主要作用：女性生殖器官和激素分泌系统。

卵巢的功能是周期性的；在人类中，卵巢功能从30多岁开始随着年龄的增长而衰退，其扰乱更年期的内分泌功能从50多岁开始。与体内其他器官相比，卵巢功能衰退较早，这与卵巢绝经的预测有关。与年龄相关的卵巢功能减退的机制是生殖医学中的一个重要问题，该问题已研究了几十年。

除了卵巢生殖功能的丧失，更年期也是衰老过程中不可避免的一部分，它会增加心血管疾病、骨质疏松症、血管运动症状、抑郁和认知障碍的风险，从而导致全身健康状况的恶化。由于越来越多的女性计划推迟生育，她们的预期寿命也在延长，因此生殖衰老和更年期日益成为重要的健康问题。然而，尽管利用各种干细胞的再生医学已被应用于维持卵巢储备和延长生殖潜能，但临床适用的有效方案尚未确定。

从成人和胎儿组织中提取的间充质祖细胞/间充质干细胞（MPCs/MSCs）被认为是治疗包括生殖衰老在内的各种疾病的新疗法来源。MPCs可分泌多种细胞因子和生长因子，调节免疫反应、细胞凋亡、存活和细胞增殖。然而，这些组织特异性MPCs的应用仍存在一些缺陷，例如，采集MPCs需要进行侵入性手术，可能会导致严重的副作用，而且由于供体的异质性，MPCs的制造方案难以标准化。此外，MPCs在培养过程中的细胞生长能力有限，因此难以获得足够数量的MPCs供临床使用。

最近，人胚胎干细胞衍生的MPC（hESC-MPC）由于其高增殖能力和易于标准化而被建议作为MPC的替代来源。尽管hESC-MPC有许多优点，但如果未完全去除未分化的hESC，则存在发生肿瘤的风险。正在进行许多研究来克服这个问题，我们的小组通过利用其高增殖能力从单个hESC-MPC克隆扩增MPC，克服了这个问题。单细胞衍生的克隆扩增hESC-MPC显着增加了细胞数量，并且在畸胎瘤形成测定中是安全的。

我们之前的研究和许多其他研究已经证明，MPC可以恢复卵巢早衰模型的功能和各种其他疾病。然而，在经历自然衰老的中年女性模型中，尚不清楚hESC-MPC是否有利于生殖力和卵巢储存的长期维持，或者它们的移植如何调节卵巢功能。

最近的一项研究重点是通过抑制mTOR来预防卵巢细胞的病理变化，从而推迟卵泡的激活和发育，延长卵巢的卵泡储备和内分泌功能。此外，卵泡周围间质组织的卵巢纤维化是肥胖引起的卵巢功能障碍的关键因素，其过程与生殖衰老相似。事实上，减少诱导高水平炎症、活性氧（ROS）、DNA损伤和细胞凋亡的不利因素可以改善卵泡质量和卵巢寿命。

在本研究中，我们发现多次移植人胚胎干细胞-间充质祖细胞（hESC-MPC）可能通过抑制细胞凋亡和纤维化来保护围绝经期雌性小鼠的卵巢功能，并可能维持卵母细胞的能力并延缓生殖衰老。

目标

目前，还没有批准的基于干细胞疗法可以在衰老过程中保留卵巢功能。为了解决这个问题，我们开发了一种针对人胚胎干细胞衍生的间充质祖细胞（hESC-MPC）的长期治疗方法。我们研究了这些细胞是否保留了抵抗卵巢衰老的能力，从而导致生殖衰老延迟。

材料和方法

在经历自然衰老的中年女性模型中，我们分析了hESC-MPC是否有利于生殖力和卵巢储存的长期维持，以及它们的移植如何调节卵巢功能。

结果

在多次导入hESC-MPCs后，对中年围绝经期小鼠的生殖周期进行了分析，以评估这些细胞在延缓生殖衰老方面的潜在治疗功能。细胞导入实验在10个月（44周）的自然老龄小鼠中开始，这些小鼠的卵巢功能与人类围绝经期的卵巢功能相似。对14个月（60周）的小鼠进行了生殖衰老评估，这些小鼠的卵巢功能与人类绝经期的卵巢功能相似（图1A和图2A）。在主要实验之前，我们进行了一项初步实验，以确定引入自然衰老小鼠模型的细胞的适当数量（图1）。

因此，我们预计多次使用hESC-MPCs会对围绝经期小鼠的生育能力保持有更好的效果，因此在主要研究中选择4°I.V组作为hESC-MPCs组（小鼠饲养至10月龄，然后每月静脉注射一次hESC-MPCs，共注射4个月）。在相同时间内静脉注射生理盐水（模拟对照）的小鼠作为对照组（图2A）。检查小鼠的发情周期（图2B和C），包括4个阶段：发情期（Pro）、发情期（Est）、发情期（Met）和绝经期（Di），每 4-5天重复一次的Pro、Est、Met和Di周期被称为 “规律发情周期”（图2D）。

由于生殖衰老会增加发情周期的长度和不规则性，我们评估了含有或不含hESC-MPCs的14月龄小鼠的发情周期。只有发情周期规律的10月龄小鼠才被纳入主要研究。对照组中14个月大的小鼠发情周期规律性极低，而hESC-MPCs组中与年龄匹配的小鼠发情周期规律性相对较高（hESC-MPCs：24.7±2.7%vs对照组：3.1±3.1%，p<0.05）（图2E），这表明hESC-MPCs延长了小鼠的生殖力。

hESC-MPCs可维持围绝经期小鼠的卵巢结构和功能

为了进一步研究施用hESC-MPC是否能延缓卵巢储备功能的衰竭，对卵巢进行了组织学分析（图3A）。结果表明，hESC-MPC治疗甚至可以延缓围绝经期小鼠卵巢储备的衰竭。

hESC-MPCs可改善围绝经期小鼠成熟卵子的排卵和胚胎发育情况

我们研究了hESC-MPCs是否能改善成熟卵子的排卵和胚胎发育，这两者都会随着年龄的增长而降低。虽然三组小鼠的排卵比例没有差异（图4A），但与3个月大的小鼠（18.7±2.6；图4B）相比，14个月大的两组小鼠（14个月大对照组，3.6±0.1；hESC-MPCs组，4.6±0.3）每只小鼠的复苏（排卵）卵子数都显著减少。此外，囊胚形成率随着年龄的增长而降低（26.8±6.4）。相比之下，与14个月大的对照组相比，hESC-MPCs组的囊胚形成率（53.4±7.4）明显提高，达到与年轻对照组相似的水平（48.7±6.8；图4C和D）。

hESC-MPC挽救围绝经期小鼠的不良生殖结局

为了进一步研究hESC-MPC对围绝经期小鼠妊娠结局的治疗功能，我们评估了两组接受hESC-MPC治疗后的生殖参数，包括交配率、分娩率、后代数量和窝产仔数。

两组雌性小鼠均与年轻的成年雄性小鼠交配。围绝经期（14个月大）小鼠的所有参数值都明显低于年轻对照组（3个月大）小鼠（所有数值如图4所示）。相比之下，经hESC-MPC处理的小鼠的交配率（图4E）和分娩率（图4F）与年轻对照组相似。虽然14个月大的对照组小鼠和经hESC-MPC处理的小鼠的产仔数没有明显差异（图4H），但hESC-MPC组每只雌性小鼠的平均后代数明显高于对照组（图4G）。这些结果表明，即使随着年龄的增长，hESC-MPCs也能部分维持生育能力。

hESC-MPCs可抑制围绝经期小鼠中与衰老相关的G-MDSCs增加和细胞炎症

与衰老相关的慢性炎症会导致纤维化并降低器官功能。因此，我们检测了卵巢中与炎症和纤维化相关基因的表达水平，以确定与衰老相关的卵巢纤维化是否与炎症介导的反应有关。如图5A所示。

随着年龄的增长，人类和小鼠体内的MDSC数量也会增加。免疫衰老也会影响老龄小鼠的MDSCs，而老龄小鼠的MDSCs会促进炎症和纤维化。因此，我们研究了将hESC-MPCs移植到老年小鼠体内是否会影响BM中MDSCs的数量和频率。结果表明，随着年龄的增长，hESC-MPCs可抑制MDSCs的扩增，并对衰老卵巢具有有益的抗炎和抗纤维化作用。

简述结果：与年龄匹配的对照组相比，多次引入hESC-MPC的围绝经期小鼠的原始卵泡和具有规则动情周期的小鼠的数量有所增加。hESC-MPCs组的雌二醇水平恢复到年轻组和成年组的水平。hESC-MPC组的胚胎发育和活产率高于对照组，表明 hESC-MPC延迟了卵巢衰老。除了对卵巢的直接影响外，hESC-MPC的多次治疗还可以通过抑制骨髓中产生的骨髓源性抑制细胞 (MDSC) 来下调炎症和纤维化相关基因，从而减少卵巢纤维化。

结论

多次引入人胚胎干细胞-间充质祖细胞（hESC-MPC）可能是预防女性生殖衰老的有效方法，并且这些细胞是细胞疗法的有前途的来源，干细胞治疗可推迟围绝经期女性的卵巢衰老并保持生育能力。

参考资料：Shin EY, Jeong S, Lee JE, et al. Multiple treatments with human embryonic stem cell-derived mesenchymal progenitor cells preserved the fertility and ovarian function of perimenopausal mice undergoing natural aging. Stem Cell Research & Therapy. 2024 Mar;15(1):58. DOI: 10.1186/s13287-024-03684-6. PMID: 38433223; PMCID: PMC10910829.

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