人羊膜上皮细胞(hAEC)因具有低免疫原性、免疫调节、旁分泌作用、在体内不形成畸胎瘤等特性,在许多疾病的研究中显示出良好的治疗效果。

作用堪比全能干细胞，重新认识人羊膜上皮细胞的细胞特性及其治疗应用

简介：人羊膜上皮细胞 (hAEC) 来源于受精后第8天左右从外胚层分化而来的羊膜外胚层。羊膜外胚层的细胞形态和转录组与外胚层有明显不同。随着分化和扩增，羊膜外胚层逐渐与外胚层分离，形成充满羊水的羊膜腔，此结构称为羊膜囊。

羊水发生发生在原条形成之前，原条形成是原肠胚形成起始的标志，这使得羊膜外胚层细胞成为原始的胚外细胞之一。hAEC紧密堆积为单层，位于羊膜的最内层，直接与羊水接触。

据报道，从妊娠早期羊膜中分离的hAEC表达TRA1-60、TRA1-81、SSEA3和SSEA4等多能性标志，这些标志在妊娠期间逐渐丢失。尽管许多临床研究表明hAEC在多种疾病的治疗中具有良好的潜力，但其具体的细胞生物学特征和治疗机制仍然不清楚。

此外，研究表明hAEC缺乏端粒酶活性，增殖能力有限，阻碍了其作为细胞产品在临床上的大规模应用和进一步的产业化。为了解决这些问题，全面了解hAEC至关重要，包括细胞特性、内在增殖能力和治疗潜力。

01人羊膜上皮细胞的来源

人羊膜上皮细胞（hAECs）的来源可以总结如下：

• 胚胎内细胞团分化：hAECs源自胚胎内细胞团分化发育而成。这些细胞位于胎盘羊膜的最内层，由受精卵发育至第8天的囊胚内的细胞团分化而来。
• 羊膜的构成：人羊膜是附着在胎盘胎儿面的半透明无血管薄膜，由5层结构组成，包括上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层（后三层统称为基质层），其中上皮层即为hAECs所在的层。
• 囊胚期上胚层分化：hAECs由胚胎发育第8-9天的囊胚期上胚层分化而来，其原始祖性仅次于源自内细胞团的胚胎干细胞。

• 羊膜腔的形成：在囊胚植入子宫内膜间质后，内细胞团分化为两层：上胚层和下胚层。上胚层是三个胚层的起源，最终将分化为胚胎。随后，内细胞团和邻近滋养层细胞之间逐渐形成一空腔，即羊膜腔。位于羊膜腔内的细胞被称为羊膜母细胞，即hAECs的前体细胞。

羊膜外胚层被认为是原始羊膜上皮细胞，在植入前后由外胚层分化而来。随后，原条将从非羊膜起源的外胚层衍生而来，这代表三个胚胎胚层和器官发生的开始（图1A）。

（A）受精卵经历快速分裂。在桑葚胚阶段，细胞表现出不同的分裂速度，导致形成内细胞团 (ICM) 和滋养外胚层。

（B）人羊膜由5层组成：1）上皮单层，2）基底膜层，3）致密层，4）成纤维细胞层和5）海绵层。

羊膜是一种重要的胚胎外组织，是动物从水生环境进化到陆生环境的重要里程碑。羊膜为胎儿提供机械保护，并分泌细胞因子和激素，促进胚胎发育。

羊膜上皮细胞分泌的蛋白质，如糖蛋白和胶原，构成了底层基底膜。羊膜上皮细胞和羊膜间质细胞主要分别位于上皮细胞层和成纤维细胞层。这两种细胞有不同的来源。羊膜上皮细胞来源于羊膜外胚层，而羊膜间充质细胞则来源于胚外中胚层，后者发育在羊膜上皮细胞之后。作为源自羊膜的两种主要细胞类型，这两种细胞都具有免疫原性低、不致瘤、伦理考虑有限等优点。

表1列出了hAECs和人羊膜间充质干细胞（hAMSCs）的特征标记。

02人羊膜上皮细胞的特点

人羊膜上皮细胞（hAECs）具有以下特点：

• 多能性：hAECs具有表达多种胚胎干细胞标记物的特点和较全面的多向分化潜能，能够向三胚层分化。

• 免疫调节性：hAECs具有免疫调节作用，可以分泌多种免疫调节因子，移植后不易产生免疫排斥反应。

• 无致瘤性：hAECs缺乏端粒酶，这决定了其在体外扩增不超过6代，避免了干细胞临床应用的致瘤性。

• 低免疫原性：hAECs具有低免疫原性，不表达MHC II类抗原和共刺激分子，减少了免疫排斥反应的发生。

• 神经细胞特性：hAECs能合成和分泌多巴胺，表达多巴胺受体D1和D2，以及多巴胺转运蛋白，能分泌神经营养因子(如BDNF、NT-3、NGF等)和其他神经递质与调质，具有向神经细胞分化的潜能。

• 分泌多种因子：hAECs能分泌多种神经递质和神经营养因子，促使宿主自身干细胞功能的活跃及自身修复。

• 抗氧化自由基能力：hAECs内含有多种分化酶，提高人体抗自由基的能力，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化氢酶等。

• 易于获取且无伦理争议：hAECs来源于胎盘，胎盘通常在分娩后作为医疗废弃物丢弃，容易获得，不涉及伦理问题。

• 促进血管生成和伤口愈合：hAECs具有调节血管形成的能力，被广泛用于组织工程，以增加血液灌注并促进伤口愈合。

• 抗肿瘤作用：hAECs对某些肿瘤如上皮性卵巢癌细胞具有抑制作用，可能通过抗增殖和促凋亡，以及调节血管生成和细胞周期等，抑制肿瘤生长和侵袭。

这些特点使得hAECs在干细胞治疗和再生医学领域具有重要的应用潜力。

03人羊膜上皮细胞的表征与扩增

尽管许多临床研究已证实hAEC具有治疗作用，但目前的体外培养扩增系统限制了其应用。原代hAEC的产量和生物学特性受产妇身体状况、胎盘大小和质量、不同羊膜部位的来源、妊娠阶段、分离和保存程序等多种因素影响。从羊膜中分离的hAEC平均数量约为1×10^8，而单次治疗通常需要0.5~1×10^8之间的数量，这导致同质细胞可能不足以对同一患者进行多次治疗。

因此，获得符合良好临床实验室规范 (GCLP) 标准的hAEC已成为一项绝对挑战。开发一种足以在体外扩增hAEC的系统需要了解hAEC的特性及其增殖机制。

04人羊膜上皮细胞的细胞标志物

人羊膜上皮细胞（hAEC）的细胞标志物包括多种胚胎干细胞标记物和多潜能干细胞的转录因子。以下是一些关键的hAEC细胞标志物：

• 胚胎干细胞表面抗原：hAEC表达胚胎干细胞表面抗原，包括SSSEA-3和SSSEA-4，以及肿瘤抗性基因TRA 1-60和TRA 1-81。
• 多潜能干细胞的转录因子：hAECs还表达多潜能干细胞的转录因子，例如Oct-4、Sox-2、Nanog和REX-1等。
• 其他抗原：hAECs还表达ATP流出泵的ATP结合暗盒超级家族成员之一的ABCG2/BCRP、CD9、CD24、上皮钙黏蛋白、整合素α6和β、肝细胞生长因子结合受体（c-met）等。
• 不表达的标记物：hAECs不表达CD34（造血干细胞及内表干细胞表面标记）、SSSEA-1、CD133（造血干细胞、内皮细胞及恶性胶质瘤细胞表面标记），弱表达c-kit(CD117)和CC趋化因子受体（CRR4）。
• 上皮标志物：hAECs表达上皮标志物角蛋白CK19，不表达间充质细胞标志物波形蛋白。
• 其他表达的分子：hAECs表达胚胎干细胞相关分子CD9, E-cadherin, PODXL, SSEA-4, SOX2, SSEA-1, Nanog, Oct-3/4。

这些标志物有助于识别和区分hAECs，并在研究和临床应用中具有重要意义。

05人羊膜上皮细胞的增殖机制

人羊膜上皮细胞（hAECs）的增殖机制涉及多个方面，以下是一些关键点：

• EGFR/ERK1信号轴的调节作用：研究表明，hAECs可以通过激活EGFR/ERK1信号轴来促进软骨细胞的增殖和细胞外基质的合成，并抑制其凋亡。这表明hAECs可能通过类似的机制影响自身的增殖。
• 抗氧化自由基能力：hAECs内含有多种分化酶，这些酶可以提高人体抗自由基的能力，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化氢酶等，这些活性因子可能间接影响细胞的增殖和代谢。
• 旁分泌因子的作用：hAECs能够分泌多种营养和免疫调节因子，这些因子可以重塑受损组织中的局部微环境，从而修复受损细胞和组织，并且这些营养因子和免疫调节因子可能在血管生成、免疫反应、细胞周期和细胞凋亡等生物学过程中起作用。这些旁分泌因子可能对hAECs的增殖有直接或间接的影响。
• 自我更新和分化潜能：hAECs表达多能干细胞特异性转录因子，例如OCT-4、SOX-2和Nanog，这些因子对于维持其自我更新和分化潜能至关重要，也可能影响其增殖能力。
• 无致瘤性：hAECs缺乏端粒酶，这决定了其在体外扩增不超过6代，避免了干细胞临床应用的致瘤性，这可能与其增殖机制有关，即它们在一定代数后会自然停止增殖。

这些机制共同作用，可能影响hAECs的增殖和维持其功能。

06细胞疗法的现状

干细胞疗法近年来已成为再生医学的重要一环。常用的细胞类型包括多能干细胞、胚胎外组织来源的细胞和成体干细胞。在干细胞临床应用中，造血干细胞（HSC）移植占据主导地位，间充质干细胞（MSC）研究则位居第二。

hAEC是形态上皮细胞，具有低免疫原性、免疫调节和抗炎作用。此外，hAEC缺乏端粒酶活性和可持续细胞分裂的潜力，使它们具有低致瘤性。因此，hAEC被认为是细胞治疗的有希望的候选者（图2）。

尽管对于hAEC治疗疾病的分子机制存在一些不确定性，无论是体内植入和分化，还是调节生化反应和细胞对损伤的反应，Wallace团队的工作已经清楚地证明hAEC无需植入或分化即可发挥修复作用。他们认为hAEC修复肺损伤的主要机制可能是向周围组织发出旁分泌信号以减少促炎和促纤维化介质。在脑缺血、帕金森病、脊髓损伤和伤口愈合方面的研究也发现了类似的结果。

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5项关于人羊膜上皮细胞“从实验室到临床”的研究

1981年，Akle等首次分离出原代hAEC，并将其移植到7名志愿者的上臂皮下。4周后，研究人员观察到所有志愿者的血液中均没有检测到HLA抗体，其中2名志愿者也没有出现淋巴细胞反应，这表明移植hAEC不会引起急性免疫排斥反应。

此后，利用hAEC进行细胞治疗已成为一种新兴的疾病治疗方法。此后，许多研究显示hAEC在临床前治疗中具有令人满意的效果，但在临床研究方面却很少有结果。

截至2024年11月，数据库中列出了25项临床试验（ClinicalTrials.gov、Anzctr.org.au 等），这些试验使用“人羊膜上皮细胞”作为治疗各种疾病的生物干预措施（表2），最有前景的包括神经系统疾病、免疫疾病和组织修复。

人羊膜上皮细胞治疗神经系统疾病

大量研究表明，hAEC具备神经元的某些生化特性，尽管具有分化为神经细胞的潜力。hAEC在治疗神经系统疾病方面最普遍接受的观点与其旁分泌信号有关。已证明hAEC能够合成和分泌神经营养因子、生长因子和神经递质，如儿茶酚胺和多巴胺，这些物质有助于促进受损神经细胞的再生。hAEC还能分泌抗炎因子，有助于减少神经炎症，改善细胞微环境，减缓疾病的进展过程。

越来越多的证据表明，在神经系统疾病动物模型中使用hAEC可以减少细胞凋亡，修复受损神经元，重建受损神经连接。有研究表明，hAEC有望成为神经系统疾病细胞疗法的候选对象。本文，我们将重点介绍hAEC在帕金森病和阿尔茨海默病中的研究。

人羊膜上皮细胞治疗帕金森病

帕金森病（PD）是一种与年龄相关的神经退行性疾病。迄今为止，PD仍无法治愈，目前可用的临床治疗旨在减缓疾病进展和缓解运动症状。在过去的几十年里，除了传统的药物和手术治疗外，越来越多的新疗法被用于治疗PD。细胞疗法在这些疗法中发挥了重要作用并取得了显著的成果。

大量动物研究表明hAEC在PD治疗中具有良好的治疗潜力。

• Zhang等进行的研究发现，hAECs立体定向移植至PD小鼠纹状体，可促进神经突和轴突纤维的生长，抑制受损多巴胺能神经元的凋亡，有助于维持神经细胞的生物学功能。同时，hAECs条件培养基也可促进体外神经突的生长，提示hAECs可能通过分泌神经营养因子来增强神经细胞的自我修复。

尽管许多研究表明hAEC能够缓解PD症状，但其潜在机制尚不清楚。已证明hAEC分泌的神经营养因子，如脑源性神经营养因子 (BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)、睫状神经营养因子 (CNTF)、制瘤素M (OSM) 和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 可在神经突生长、轴突生长、突触可塑性和神经细胞表型方面促进神经细胞的存活和再生。这些研究提供了一种观点，即hAEC有望成为一种新的PD治疗方法。

人羊膜上皮细胞治疗阿尔茨海默病

阿尔茨海默病 (AD) 是一种与年龄相关的进行性神经退行性疾病，与记忆力减退和认知障碍有关。目前，AD尚无明确的治愈方法，目前可用的治疗干预措施无法逆转甚至阻止AD的进展过程。

• 与帕金森病类似，hAEC对AD动物模型也有良好的治疗作用。据报道，通过立体定向注射或静脉注射将hAEC移植到AD小鼠模型（Tg转基因小鼠）的侧脑室，可显著改善其行为表现，同时减轻空间记忆缺陷，促进前脑海马区胆碱能神经元生长，并增加乙酰胆碱的产生。
• 此外，hAEC移植可减少Aβ沉积形成的斑块并降低β-分泌酶 (BACE) 活性，而BACE活性对于调节Aβ40和Aβ42的产生至关重要。

这些研究表明hAECs将成为治疗AD的有希望的候选药物。

人羊膜上皮细胞治疗免疫疾病

hAEC具有免疫调节特性。因此，hAEC有望在免疫疾病的临床应用中扩大其治疗潜力。在我们之前的研究中，将hAEC移植到通过在NCG小鼠中注射人PBMC建立的急性GVHD小鼠模型中，显著减少了炎症细胞向靶器官和器官病变的浸润，提高了小鼠的存活率，延长了它们的寿命。

基于这些动物研究，2022年，中国国家药品监督管理局 (NMPA) 药品审评中心 (CDE) 批准了hAEC用于aGVHD治疗的首个新药研究 (IND) 申请，并于2023年11月启动了I期临床试验。这项I期临床研究的结果将加强hAEC在治疗其他免疫疾病方面的应用潜力。

大量研究表明，hAECs和hAECs条件培养基 (hAECs-CM) 具有多种免疫调节和抗炎特性。它们分泌多种抗炎因子，如MIF、TGF-β、IL-10和PGE2，因此，hAECs可以有效抑制T细胞增殖和活化，减少促炎细胞因子的产生。

hAEC已用于治疗多种免疫介导的炎症疾病，如自身免疫性葡萄膜炎、桥本甲状腺炎、系统性红斑狼疮、糖尿病和多发性硬化症 (MS)。

人羊膜上皮细胞治疗组织损伤与修复

hAEC的生物学功能包括保护胎儿免受机械损伤，分泌激素和因子，支持胚胎发育，因此hAEC也可能有利于组织修复。关于hAEC在组织修复中的应用研究很多，包括子宫、卵巢、肾脏、角膜、肝脏和肺脏的损伤。

关于hAEC作为组织修复生物干预的临床研究也在宫腔粘连（NCT03381807）、Asherman综合征（NCT03223454）、原发性卵巢功能不全/卵巢早衰/不孕症（NCT02912104、NCT03207412）、支气管瘘（NCT02959333）、痉挛性脑瘫（NCT03107975）和不愈合骨折（NCT03031509）等领域进行。

在一项关于持续性角膜上皮缺损 (PED) 的临床研究中，发现hAEC与胶原蛋白护盾结合使用可促进PED消退。1例患者接受两轮hAEC接种胶原蛋白护盾治疗后，PED完全消退；2例患者接受四轮hAEC接种胶原蛋白护盾治疗后，PED完全消退；所有患者接受治疗后7至12周内出现视力下降，且所有患者均保持临床改善，平均随访时间为6.3个月。

除了上述情况的应用外，hAEC还表现出对心肌梗塞、脑出血、视网膜变性、肺泡缺损、肺损伤、慢性肝功能衰竭、腺体损伤、内耳损伤等的治疗潜力。所有这些都需要未来的临床研究，然后才能转化为治疗产品来帮助患者。

08结论和未来挑战

尽管近年来干细胞疗法在治疗各种疾病方面取得了进展，包括ESC、iPSC和MSC，但关于它们的效力、稳定性、致癌性、免疫反应、细胞来源和伦理道德方面仍存在许多不清楚的问题和未解决的问题。人们对其治疗潜力的主要担忧是致瘤性高风险和侵入性。

hAEC来源于人羊膜，作为医疗废物，羊膜易于获取且伦理争议较少，并且不具有致瘤性和低免疫原性潜力。人们已经研究了hAEC在各种疾病中的应用，并探索了相关的潜在机制，使其成为治疗疾病的更好的替代细胞来源。

参考资料：Yang J, Lu Y, Zhao J, Luo Y, Hao W, Zhang W and He Z (2024) Reinvesting the cellular properties of human amniotic epithelial cells and their therapeutic innovations. Front. Immunol. 15:1466529. doi: 10.3389/fimmu.2024.1466529

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