渐冻症的治疗方法：间充质干细胞和细胞外囊泡的作用

肌萎缩性侧索硬化症 (ALS) 是一种致命的神经退行性疾病（渐冻症），其特征是进行性肌肉麻痹，这是由运动皮质脑干和脊髓中的运动神经元退化决定的。ALS 的发病机制仍不清楚，尽管大量研究表明涉及几种改变的信号通路，例如线粒体功能障碍、谷氨酸兴奋性毒性、氧化应激和神经炎症。

迄今为止，所提出的治疗策略针对的是这些改变中的一个或几个，对ALS患者的病程和存活率的影响很小。ALS发病机制中不同机制的参与强调了针对多个方面的治疗方法的必要性。间充质干细胞 (MSC) 可以支持运动神经元和周围细胞，减少炎症，刺激组织再生并释放生长因子。在此基础上，间充质干细胞被提议作为治疗渐冻症的有前途的候选者。然而，由于细胞疗法的缺点，干细胞释放的细胞外囊泡 (EV) 的可能治疗用途引起了越来越多的兴趣。

意大利维罗纳维罗纳大学神经科学、生物医学和运动科学系综述总结了肌萎缩性侧索硬化症的主要病理机制和迄今为止提出的相关治疗方法，重点是间充质干细胞治疗渐冻症的临床应用。此外，讨论了EV的性质和特征及其在概括干细胞作用中的作用，阐明了这些囊泡如何以及为什么可以为肌萎缩性侧索硬化症治疗提供新的机会。MSC已被提议作为治疗 ALS的有前途的候选者。

肌萎缩性侧索硬化症的发病机制

鉴定ALS中运动神经元退化的分子机制对于理解疾病进展和开发新的治疗方法至关重要。尽管SOD1突变与ALS相关已有二十多年，但突变体SOD1的作用模式和随后的神经变性/神经毒性的潜在机制仍不清楚。在这方面已经提出了几个假设，并且看起来可能是机制的组合，而不是单一的机制，导致了ALS的神经变性，指向多因素的发病机制（图1)。

图1：肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 的发病机制。该疾病的病理生理机制似乎是多因素的，有几种机制导致神经变性。

• 线粒体功能障碍：线粒体损伤是许多神经退行性疾病的共同特征。
• 谷氨酸兴奋性毒性：谷氨酸是中枢神经系统 (CNS) 中的主要兴奋性神经递质，在突触前末梢合成并扩散到突触间隙，激活特定的突触后受体并触发动作电位。
• 氧化应激：自由基或 ROS 是氧代谢的天然产物。当 ROS 的产生高于细胞去除它们的能力时，使用术语氧化应激。这导致 ROS 的积累，从而对细胞结构和大分子（例如蛋白质、DNA 和 RNA）造成不可逆转的损害。
• 蛋白质聚集体：蛋白质聚集体是许多神经退行性疾病的病理学标志，例如阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、亨廷顿舞蹈症和肌萎缩侧索硬化症。
• 神经丝的积累：NFs在细胞体和轴突中的积累和/或聚集，以及磷酸化NFs在细胞体中的异常定位是ALS的典型病理标志。
• 神经炎症：ALS和其他神经退行性疾病的一个共同特征是神经炎症反应，其特征是神经元损伤部位的小胶质细胞活化、星形胶质细胞增生和免疫细胞浸润。

肌萎缩性侧索硬化症的治疗方法

鉴于肌萎缩性侧索硬化症发病机制的复杂性，迄今为止还没有有效的治疗方法来治愈或显着改善患者的生活质量。尽管如此，已经提出了几种治疗策略来缓解渐冻症患者的症状并改善其生活质量。

药物治疗

1994年利鲁唑被批准用于治疗渐冻症，但它只能延长大约3个月的寿命。2017年，一种新药依达拉奉在美国注册。目前，利鲁唑和依达拉奉(Radicava®)是唯一被FDA批准的治疗药物。虽然这些药物对生存有一定的益处，但终不能实现逆转或者治愈。

干细胞疗法

干细胞正在成为神经元替代和再生的一种有前途的治疗方法，成为患有不同神经退行性疾病（包括肌萎缩性侧索硬化症）的患者寄予厚望和期待的源泉。干细胞作为治疗方法的使用引起了极大的兴趣，因为它们能够归巢到受损部位，刺激组织修复和再生，并指导它们响应细胞外信号进行分化。

干细胞是一组具有自我更新能力和分化成多种细胞类型的细胞。它们通常分为两大亚型： 胚胎干细胞 (ESC)，起源于囊胚的内细胞团，具有产生所有三个胚层的能力；成体干细胞，可以分化成不同器官的多种细胞类型的特化细胞，通常由起源的胚层决定。在不同的干细胞类型中，最常用于神经系统疾病的是：ESC、神经干细胞 (NSC)、MSC 和诱导多能干细胞 (iPSC)。干细胞的最佳来源应根据其生存、迁移至受损组织、移植和分化的生物学特性来选择。

干细胞治疗的主要目标是细胞替代和神经保护。第一个目标将通过干细胞分化成与疾病有关的特定细胞亚型来实现，目的是替换死细胞。第二个目标涉及基于干细胞释放营养因子和去除神经毒性分子的能力的干细胞的使用，在受损区域的微环境中提供局部支持，充当神经保护者。

在用于治疗神经退行性疾病的不同类型的干细胞中，间充质干细胞作为有前途的候选者似乎引起了最高的兴趣。MSC可以从多种胎儿和成人组织中分离出来，例如骨骼肌、胎盘、脐带、血液和脂肪组织。脂肪组织越来越受到关注，因为它可以从吸脂术中大量获得，从而允许脂肪来源的MSC (ASC) 的自体移植。

MSC的应用有几个技术优势。首先，它们的分离是安全和容易的，它们在体外的扩增很简单，而且在体外和体内都证明它们可以分化成神经样、神经胶质样和星形细胞样细胞。考虑到自体移植的可能性，MSC 对肿瘤变化的敏感性较低，并且不需要免疫抑制治疗来防止排斥反应。此外，与其他干细胞一样，移植和迁移后，MSC会被吸引到受损区域，在那里它们会增加神经营养因子的释放。

干细胞移植治疗渐冻症的临床试验

在过去的几年中，许多基于细胞的ALS临床试验都使用了MSC，并报告了MSC对ALS患者给药的可行性、安全性和免疫学效果（表2)。

干细胞类型	移植方式/细胞数量	试用状态和详细信息	参考
自体骨髓间充质干细胞	椎管内（14–60×106个细胞）	该方法安全可行。一些患者表现出神经肌电图改善	德达等人(2009)
自体骨髓间充质干细胞	鞘内（54.7×106±17.4×106个细胞） 静脉内（23.4±6×106个细胞）	该方法安全、可行，并可立即产生免疫调节作用。I期完成，II期开放以评估不同剂量细胞的初步效果	Karussis 等人(2010年)
自体骨髓间充质干细胞	椎管内（15–110×106个细胞）	该方法安全可行，没有毒性、不良事件或异常细胞生长的迹象。第一阶段完成；无长期有害后果，但疾病进展似乎并未减缓	马志尼等人( 2010); 马志尼等人。(2012)
自体骨髓间充质干细胞	椎管内（138–602.87×10 6 个细胞）	该方法安全可行。尸检后未发现衰退加速，脊髓运动神经元数量增加	布兰克等人(2012)
自体骨髓间充质干细胞	脑室内（1×106个细胞/kg）	该方法安全可行	贝克等人(2012)
自体骨髓间充质干细胞	运动皮层（2.5–7.5×105个细胞）	该方法安全可行，接受治疗的患者具有更高的显着生存率	马丁内斯等(2009); 马丁内斯等。(2012)
自体BM-MSC和神经诱导的MSC	静脉内（42–102×106个细胞）和腰椎内（5–9.7×102×106个细胞）	该方法安全，延缓疾病进展，提高患者生活质量	Rushkevich等人(2015年)
自体骨髓间充质干细胞	鞘内（1–2×106个细胞） 肌内（1–48×106个细胞）	该方法安全可行。I期完成，II期开放以评估不同剂量细胞的初步效果	彼得鲁等人( 2016 年)

然而，尽管干细胞介导的疗法代表了一种治疗ALS和其他神经退行性疾病的新方法，但迄今为止，与安慰剂治疗的对照相比，尚未获得对疾病进展的显着影响，并且在广泛的临床转化之前需要解决关键问题。

首先，有必要使用标准化协议确定细胞向CNS的输送，并考虑给药途径、细胞剂量、时间和细胞注射次数。此外，鉴于干细胞的高增殖能力，应防止移植细胞的致癌转化并避免其免疫排斥。

在证明只有一小部分注射的干细胞可以到达损伤部位、移植和分化后，干细胞的有益作用是间接的并且很可能取决于它们的旁分泌活动的想法变得越来越普遍。干细胞产生大量含有细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白质和核酸的EV，并且可以对细胞产生显着影响，介导细胞间通讯。这些观察结果导致了这样的假设，即干细胞通过分泌EV发挥其有益作用，从而增强受损区域释放其内容物的修复。因此，EV可以用作一种新型的无细胞治疗方法，避免与使用细胞相关的所有风险。

细胞外囊泡

细胞间通讯在多细胞生物中起着重要作用。它可以通过细胞之间的直接接触或通过分泌分子（例如生长因子、趋化因子和细胞因子）来介导，从而对附近的细胞产生影响。在过去的几十年中，提出了一种新的细胞通讯机制，涉及EV的细胞间转移。这些囊泡代表了在细胞之间转移膜和细胞质蛋白质、脂质和核酸的载体，成为细胞间微环境的组成部分，并在许多生理和病理过程中发挥作用。

外泌体的治疗应用

由于外泌体和微泡可以远距离传递生物信息，因此越来越多的人关注这些囊泡作为病理过程抑制因子的促进剂。由于外泌体比微泡小并且能够穿过血脑屏障，在这里我们将重点关注外泌体作为神经退行性疾病（例如肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默氏症和帕金森氏病）的潜在治疗工具的用途。

越来越多的证据表明外泌体具有抗炎特性，可减少活化的炎症小胶质细胞的数量，支持少突胶质细胞并保护神经元。此外，鼻内注射的外泌体被迅速输送到大脑，在那里它们可以被小胶质细胞吸收。由于如上所述，神经炎症是神经退行性疾病的共同特征，神经炎症反应的抑制和容易到达中枢神经系统的可能性对于治疗这些病症非常重要。

使用外泌体治疗神经退行性疾病的越来越多的关注源于外泌体穿过血脑屏障的能力，血脑屏障是将脑实质与中枢神经系统中的循环血液分开的生理屏障。如前所述，目前对神经退行性疾病的治疗通常是有症状的，不会阻止退化过程；治愈这些病症的主要问题是细胞和药物无法穿过血脑屏障。最近的研究报告说，与微泡不同，外泌体可以穿过血脑屏障：假设是外泌体被内皮细胞内化，并且通过释放特定的货物，它们影响细胞连接的完整性，增加细胞之间的渗透性并允许大量进入中枢神经系统中的囊泡，在那里他们可以发挥神经保护作用（图2)。

结论和未来展望

科学界对间充质干细胞作为神经退行性疾病的潜在治疗方法的兴趣是由于它们能够迁移到受损组织、分化并促进修复过程。除了这些特点，ASC也很容易获得，可用于自体移植，避免可能的细胞排斥反应。这些特性使ASC 成为基于细胞替代和细胞分化的细胞疗法的候选者。由于ASC的有益作用可能是由于旁分泌活动而不是它们的植入，因此科学界已将重点从细胞转移到EV，由于其内容，EV可以重现ASC效应，并可能为用于治疗ALS的非细胞疗法。这种创新疗法很容易转移到ALS患者身上，因为EV将从自体ASC中获得，并且会保留其来源的免疫特性，避免免疫原性反应。

鉴于EV可能应用于ALS，囊泡需要穿过BBB才能到达损伤部位，并且在EV中，外泌体具有所需的特性。为了测试外泌体在ALS中的作用，我们最近证明，在ALS的体外模型中施用外泌体在氧化损伤后发挥神经保护作用，支持外泌体可以概括和改善干细胞疗法的神经保护作用的观点。

主要参考资料：

[1]:Bonafede R, Mariotti R. ALS Pathogenesis and Therapeutic Approaches: The Role of Mesenchymal Stem Cells and Extracellular Vesicles. Front Cell Neurosci. 2017 Mar 21;11:80. doi: 10.3389/fncel.2017.00080. PMID: 28377696; PMCID: PMC5359305.

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