间充质干细胞治疗肝硬化的现状及未来无细胞治疗的展望

肝硬化是一种可导致肝功能衰竭的慢性疾病。目前，降低死亡率的可行选择是肝移植。然而，移植手术是高度侵入性的。因此，已经开发出基于细胞的疗法作为替代方案。基于临床前研究的有希望的发现，一些新的试验已经注册。

目前肝纤维化的治疗方法分为五类：

• 1) 控制原发性肝病，
• 2) 靶向HSC受体-配体相互作用和细胞内信号，
• 3) 抑制纤维发生或基质降解。
• 4) 减少活化HSC的数量，
• 5) 基于细胞的治疗。

目前细胞的疗法主要关注改善肝纤维化，但它也能够产生其他有益效果（包括减少炎症和促进肝脏再生）。

其中之一是自体骨髓细胞输注疗法，自体骨髓细胞输注 (ABMi) 疗法的第一项临床研究于2003年开始，其中患者自身的骨髓细胞被采集并重新注射。在这种疗法中，ABMi可改善肝硬化患者的肝纤维化并改善肝功能（如血清白蛋白水平升高、腹水减少和Child-Pugh评分降低所示），而不会引起任何重大不良事件。ABM i还促进人体肝脏中肝脏固有再生的顺序激活。

现在，大多数试验都集中在适合同种异体给药的低免疫原性间充质干细胞 (MSC) 上。然而，尽管进行了大约20年的研究，只有有限数量的基于细胞的疗法进入了常规实践。此外，基于细胞的疗法的潜在缺点包括对可能施用的细胞数量的限制，以及它们无法渗透目标器官。

另一方面，这些研究表明，间充质干细胞作为“传导细胞”，通过细胞外囊泡（EV）或外泌体信号调节包括巨噬细胞在内的宿主细胞，从而改善肝纤维化并促进再生。因此，利用细胞衍生的EV或外泌体的无细胞疗法的概念正在引起人们的关注。无细胞疗法可以安全地大剂量给药，并且能够渗透靶器官。

然而，无细胞疗法的发展也面临着一系列挑战，而且这种疗法在肝病的背景下可能无法完全治愈。这篇综述描述了细胞疗法研究的历史和无细胞疗法的最新进展，并讨论了对更有效疗法的需求。

干细胞疗法及无细胞疗法治疗肝硬化的前景

干细胞治疗：间充质干细胞和巨噬细胞治疗肝硬化的特性

间充质干细胞的主要治疗（抗炎、抗纤维化、抗氧化和血管生成）作用是由于它们的可溶性产物，包括趋化因子、细胞因子、营养因子、EV和外泌体。间充质干细胞治疗肝硬化的主要机制是减少炎症。

另一个重要的MSC特征通常是低免疫原性。临床研究表明，它们在影响广泛器官（包括肝脏、神经、肺、心脏和肠道）的疾病中具有治疗潜力。

巨噬细胞表现出多样的表型和高可塑性，包括两种主要的代表性表型：“经典激活”(M1) 和“交替激活”(M2)。在肝损伤期间，促炎性M1巨噬细胞通过激活HSC和肌成纤维细胞促进纤维化。相比之下，在肝损伤过程稳定后，M2型巨噬细胞有助于炎症消退和纤维化逆转，后者部分通过基质金属蛋白酶。此外，如前所述，巨噬细胞能够通过产生HGF、OSM和Wnt3A来影响肝干/祖细胞的分化和表型命运决定。

MSC也会产生相同的因子（TSG-6、PGE2和IL-13），并以类似的方式促进宿主巨噬细胞的极化。此外，我们之前曾报道过，MSC促进宿主嗜中性粒细胞和单核细胞的肝脏浸润，从而通过产生MMP促进纤维化改善。这些发现表明，远程MSCs充当“传导细胞”（图2)，通过包括EV或外泌体在内的可溶性因子调节巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞的功能，从而改善肝纤维化并促进肝再生。

干细胞治疗：间充质干细胞和巨噬细胞治疗肝病的临床试验

尽管MSCs和巨噬细胞都代表了用于细胞治疗的有前途的候选者，但目前的大多数临床试验都集中在MSCs 上。根据ClinicalTrials.gov的数据，超过1,100个间充质干细胞治疗的临床试验已经在各个学科注册，其中 51个在2006年之后开始研究基于细胞的肝病治疗。此后，基于细胞的治疗临床试验注册数量（包括骨髓、脂肪组织、脐带组织和牙髓在内的细胞来源，以及包括外周静脉和动脉注射在内的给药途径，随着该方法获得认可，逐渐增加到顶峰。

2017年，日本注册了一项I期和II期临床试验（日本首次涉及MSC的临床试验），重点是在肝硬化患者中输注脂肪来源的MSC（NCT：03254758）。涉及同种异体间充质干细胞（不使用免疫抑制剂）的临床试验在完成I期后进入II期。但是，自2017年以来，临床试验的数量一直在下降（图3)。这种趋势可能是由于新颖性下降，将临床前研究转化为临床干预的进展缓慢，以及将重点转向包含EV或外泌体的无细胞疗法的趋势。

此外，为了描述以MSC为导向的临床试验的最新趋势，我们根据ClinicalTrials.gov（表格1). 其中大部分在亚洲国家注册。研究在细胞来源、自体与同种异体性质以及肝硬化的病因学方面各不相同。然而，在大多数研究（12项中的11项）中，MSC给药是通过外周注射每剂约1×10⁶MSC/kg。研究不仅关注肝硬化，还关注急性慢性肝衰竭 (ACLF)。由于MSCs在炎症期间表现出更强的治疗效果，因此它们在ACLF的情况下可能特别有效。总而言之，许多面向MSC的临床试验尚未超过I期或II期。

关于以巨噬细胞为导向的细胞疗法，爱丁堡大学也报道了进一步阐明巨噬细胞特征的临床试验。静脉内自体巨噬细胞治疗的首次人体1期剂量递增试验纳入了9名患有肝硬化和终末期肝病 (MELD) 评分为10–16的成人模型。在该试验中，巨噬细胞是从患者单核细胞白细胞分离术衍生的单核细胞中产生的，该单核细胞在CSF-1存在的情况下进行培养。尽管巨噬细胞可能具有免疫原性，但未报告输血反应、剂量限制性毒性或巨噬细胞活化综合征，并且所有参与者在1年时仍然存活且未进行移植。

此外，1年后，9名患者中有7名MELD评分下降，9名患者中有5名肝纤维化标志物下降。由于巨噬细胞也是肝脏再生的重要组成部分，因此预计会加速这一领域的研究。

干细胞治疗：优点和局限性

如前所述，基于细胞的疗法具有许多优点。尤其是对于MSC，细胞相对容易获得、培养、扩增、表征质量控制、计数和评估活力。此外，由于MSC在炎症过程中治疗效果增强，预处理可以增强其治疗效果。最后，细胞修饰的许多途径都是可能的。尽管施用的细胞被困在肺血管系统中，但现有临床试验报告的主要不良事件很少，包括肺栓塞。尽管由于基于免疫原性的限制，施用的巨噬细胞是自体的，但它们现在可以通过侵入性较小的方法获得。此外，在肝脏内局部引发和影响宿主巨噬细胞发育的能力（即不需要外源性给药）将是一个更具吸引力的可能性。

然而，基于细胞的疗法也有一定的局限性。例如，对肺栓塞风险的担忧继续限制剂量，并且施用的细胞不会进入靶器官。尽管细胞确实继续发挥远程治疗作用，但直接作用于受损部位的治疗剂将是更可取的。此外，鉴于干细胞的分化倾向，在长期培养过程中很难保持稳定的表型。因此，商业化需要严格的质量控制。这种担忧推动了对替代治疗策略的探索，而无细胞疗法可能会克服与细胞疗法相关的一些局限性。

未来的无细胞疗法：EVS和外泌体的特征

细胞自然释放的膜结合颗粒的通用术语是EV；外泌体是这些的亚型。EV和外泌体曾经被认为是细胞碎片的“垃圾袋”，现在正在探索它们作为下一代诊断和治疗工具的潜力。异类EV包含各种不同大小、不同含量的颗粒。具体而言，外泌体的直径为40-100nm——对应于蔗糖溶液中1.13-1.19 g/mL的密度——并且可以通过100,000×g的超速离心沉淀。它们包含蛋白质、信使RNA、转移RNA、微小 RNA、基因组 DNA 和互补 DNA的混合物。

关于肝病，我们之前曾报道过MSC表现出远程治疗效果，这是一种可归因于EV或外泌体的现象。此外，据报道，外泌体可改善肝硬化小鼠的肝纤维化，在小鼠肝损伤模型中促进肝再生和肝细胞增殖（通过上调 Bclxl 蛋白），通过抑制巨噬细胞缓解急性肝衰竭NLRP3炎性体活性（另外表明它们在急性肝损伤期间的潜在效用），并改善D-半乳糖胺和肿瘤坏死因子-α诱导的小鼠肝衰竭后的存活率。

未来的无细胞疗法：涉及EVS和外泌体的临床试验

为了描述相关的近期临床研究趋势，我们确定了在ClinicalTrials.gov上注册的面向EV或外泌体的临床试验。结果包括侧重于外泌体治疗应用和癌症诊断外泌体分析的试验。不包括观察性研究，注册了26项面向外泌体的治疗性临床试验。其中，10个专注于癌症诊断；三个分别侧重于肺部疾病、神经系统疾病和皮肤病；两个分别关注心脏病、眼科疾病和多器官衰竭，一个关注代谢疾病（图4)。据我们所知，目前还没有注册以EV或外泌体为导向的针对肝病的临床试验。

未来的无细胞疗法：优点和局限性

鉴于EV和外泌体的直径较小，静脉内给药后血栓形成的相关风险被认为相对于干细胞（例如，MSC）所造成的风险要低得多。如果确认无细胞治疗效果是剂量依赖性的，那么使用大量EV或外泌体的能力将是一个显着优势。此外，EV或外泌体直接浸润受损靶器官的能力可能会比远距离干细胞产生更大的疗效。一些研究甚至检验了EV或外泌体在靶向药物递送中的应用。

然而，尽管无细胞疗法克服了与细胞疗法相关的许多局限性，但前者也有其局限性。如前所述，目前还没有用于生产大量EV或外泌体的标准化方法。此外，尚不清楚使用分离的EV或外泌体是否排除了基于细胞的治疗相关治疗效果的重要因素。最后，由于无细胞疗法的快速发展，围绕无细胞疗法的相关医学法律规范尚未充分建立。显然，无细胞疗法领域仍处于起步阶段，需要进行大量的进一步研究。

结论和未来展望

基于干细胞治疗肝硬化已被开发为肝移植的替代治疗肝病的方法，但尚未取得超越早期临床试验的进展。尽管如此，无细胞疗法——克服了与细胞疗法相关的一些局限性——作为下一代治疗技术已经在开发中，与肝病相关的临床试验有望在不久的将来开始为肝病患者带来新的希望。

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